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IX Congreso nacional de la Asociación de Investigación en Visión y Oftalmología (AIVO) (parte 1)
E1 23 y 24 de noviembre de 2012 se realizó en la ciudad de Buenos Aires el VII Congreso Nacional de la Asociación de Investigación en Visión y Oftalmología (AIVO), capítulo argentino de la Association for Research in Vision and Ophthalmology- (ARVO), Estados Unidos. El comité organi-zador estuvo constituido por el Dr. Juan Gallo, presidente de AIVO, y los doctores Pablo Franco, Juan Oscar Croxatto, Ruth Rosenstein, Angela Suburo, Emiliano S. López y Pablo Sande.
Esta importante reunión tuvo la destacada participación de dos invitados extranjeros: la Dra. Valeria Cantó-Soler, quien se desempeña en el Wilmer Eye Institute, de Baltimore (Estados Unidos) y el Dr. Paulo Stanga, quien trabaja en el Manchester Royal Eye Hospital, Reino Unido, quienes participaron con las ponencias principales en. las denominadas Conferencias AIVO. Por otra parte, cabe destacar que la Legislatura de la Ciudad de Buenos Aires distinguió a ambos investigadores declarándolos personalidades destacadas de la ciudad y haciéndoles entrega de sendas distinciones el 23 de noviembre de 2012 en el Salón. Eva Perón de la Legislatura porteña,
Valeria Cantó-Soler estudió en la Universidad Nacional de Córdoba, fue becaria del CONICET y recibió su doctorado en Ciencias Biomédicas en la Universidad Austral en 2002. Después de un período de entrenamiento posdoctoral en el Wilmer Eye Instaure, fue incorporada al cuerpo académico de la johns Hopkins Medical Schod en 2006.
Paulo Stanga es oftalmólogo egresado de la Universidad de Buenos Aires y actualmente se desempeña como profesor asociado de Oftalmología y oftalmólogo consultor en el Manchester Royal Eye Hospital (Gran Bretaña). Su interés se centra en la cirugía vitreorretinal y en la regeneración de la visión.
El programa del Congreso AIVO incluyó la presentación de 40 trabajos de investigación básica y clínica. Todas las presentaciones se realizaron en sesiones imicas con inclusión de todos los asistentes y con una valiosa y enriquecedora participación interactiva por parte de los investigadores básicos y los oftalmólogos asistentes.
Cabe destacar la participación de jóvenes graduados de distintas áreas del conocimiento (biología, física, química, farmacología, psicología y medicina) quienes dan testimonio del crecimiento de las investigaciones relacionadas con la visión.
A continuación se transcriben los resúmenes del congreso, gracias a la generosa autorización del presidente de la AIVO, el Dr. Juan Gallo. Dichos resúmenes se traducen al inglés y al portugués, los otros dos idiomas aceptados por nuestra revista.
Oftalmología Clínica y Experimental 9th National meeting of the Asociación de Investigación en Visión y Oftalmología (AIVO) [Association for Research in Vision and Ophthalmology] (part I)
The 9th National Meeting of the AIVO, the Argentínian chapter of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO), U.S.A., was held in the city of Buenos Aires on November 23 and 24, 2012. The organizing committee was made up of Dr. Juan Gallo, AIVO President, and Drs. Pablo Franco, Juan Oscar Croxatto, Ruth Rosenstein, Angela Suburo, Emiliano S. López and Pablo Sande.
This important meeting had the participation of two keynote foreign guest speakers: Dr. Valeria Cantó-Soler, who has a position at the Wilmer Eye Institute of Baltimore (U.S.A.) and Dr. Paulo Stanga, who works at the Manchester Royal Eye Hospital, Great Britain. Both of them were in charge of the main lectores within the framework of what has been called AIVO Lectures. It should be stressed that both researchers were declared outstanding personalities of the city by the City Council of Buenos Aires and they were conferred distinctions on Noveinber 23, 2012 at the Eva Perón Room of the City Council of Buenos Aires.
Valeria Cantó-Soler obtained her degree at the National University of Cordoba, she served a fellowship program at the CONICET and obtained her doctorate degree in Biomedical Sciences from Universidad Austral in 2002. Alter her postdoctoral traíning at the Wilmer Eye Institute, she joined the academic staff of the Johns Hopkins Medical School in 2006.
Paulo Stanga obtained his degree as ophthalmologist at the University of Buenos Aires and currently holds the positon of Associate Professor in Ophthalmology and Consultant Ophthalmologist at the Manchester Royal Eye Hospital (Great Britain). His main interest focuses on vitreoretinal surgery and vision. restoration.
The AIVO Meeting program included the presentation of 40 basic and clinical research papers. All presentations were made in single sessions with the inclusion of all attendants and with a valuable and fruitful interactive participation of basic researchers and ophthalmologists who attended the meeting.
The participation of graduated young attendants from different fields of knowledge (biology, physics, chemistry, pharmacology, psychology and medicine), who can give testimony of the growth of research related to vision, should be stressed.
Here we will reproduce the abstracts of the presentatíons made during the meeting, thanks to the generous authorization of the President of the AIVO, Juan Gallo. These abstracts have been translated finto English and Portuguese, the other two languages accepted by our journal.
IX Congresso nacional da Asociación de Investigación en Visión y Oftalmología (AIVO) [Associayáo para Pesquisa em Visáo e Oftalmologia] (parte i)
Os días 23 e 24 de novembro de 2012 teve lugar na cidade de Buenos Aíres o IX Congresso nacional da ANO, apartado argentino da Association forResearch in Vision and Ophthalmology (ARVO), Estados Unidos. O comité organizador esteve constituido pelo Dr. Juan Gallo, presidente da AIVO e os doutores Pablo Franco, Juan Oscar Croxatto, Ruth Rosenstein, Auge
laSuburo, Emiliano S. López e Pablo Sande.
Essa importante reuniáo teve a destacada participado de dois invitados estrangeiros: a Dra. Valeria Cantó-Soler, quem se desempenha noWilmer Eye Institute, de Baltimore (Estados Unidos) e o Dr. Paulo Stanga, quem trabalha no Manchester Royal Eye Hospital, Reino Unido. Eles foram os encarregados das principais palestras nas denominadas Palestras AIVO. Além disso, convén destacar que a Legislatura da Cidade de Buenos Aires distinguivambos os pesquisadores: no dia 23 de novembro de 2012 no saláo Eva Perón da Legislatura portenha foram declarados pessoalidades destacadas da cidade e entregaran-lhes várias distincóes.
Valeria Cantó-Soler estudou na Universidade Nacional de Córdoba, foi bolseira do CONICET e recebeu sets doutorado em Ciéncias Biomédicas na Universidade Austral no ano 2002. Depois de um períodode treinamento de pós-doutoramento no Wilmer Eye Institute, foi incorporada ao corpo académico daJohns Hopkins Medical School em 2006.
Paulo Stanga é oftalmologista formado na Universidade de Buenos Aires e atualmente se desempenha corno professor associado de Oftalmologia e como oftalmologista consultor no Manchester Royal Eye Hospital (Grá Bretanha). Seu interesse está centrado na cirurgia vitreorretiniana e na regenerado da visáo.
O programa do Congresso AIVO incluiu a apresentnáo de 40 trabalhos de pesquisa básica e clínica. Todas as apre-sentnóes foram realizadas em sessóes ¿micas com indusáo de todos os assistentes e com urna valiosa e enriquecedora participado interativa por parte dos pesquisadores básicos e os oftalmologistas assistentes.
Convém destacar a participado de jovens graduados de distintas áreas do conhecimento (biologia, física, química, farmacologia, psicologia e medicina) quem dáo testemunho do crescimento das pesquisas relacionadas com a visáo.
A seguir se transcrevem os resumos do congresso, gratas á generosa autorizado do presidente da AIVO, o Dr. Juan Gallo. Esses resumos estáo traduzidos ao inglés e ao portugués, as outras duas línguas aceitas por nossa publicado.
CONFERENCIAS AIVO/ AIVO LECTURES / PALESTRAS AIVO
Generación de retinas tridimensionales in vitro a partir de células madre humanas pluripotentes inducidas
Dra. Valeria Cantó-Soler
Wilmer Eye Instítute, School of Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, Estados Unidos.
La invitada especial presenta un sistema in vitro recientemente establecido en su laboratorio, capaz de dirigir a las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSC) a recapitular los principales eventos de diferenciación celular que ocurren durante el desarrollo del ojo in vivo, incluyendo la formación de una retina estratificada.
In vitro generation of tridimensional retinas from burnan induced pluripotent stem cells
The special guest speaker presents an in vitro system recen tly implemented in her laboratory that is capable of directing human induced pluripotent stem cells (hiPSC) to recapitulare the main events of cell differentiation occurring during the development of the eye in vivo, including the formation of a stratified retina.
Gerafáo de retinas tridimensionais in vitro a partir de células-tronco humanas pluripotentes induzidas
A convidada especial apresenta um sistema in vitro recentemente estabelecido em seu laboratório, capaz de levar as células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC) a sintetizar os principais eventos de diferenciagáo celular que ocorrem durante o desenvolvimento do olho in vivo, incluindo a forma0o de urna retina estratificada.
Prótesis retinal electrónica para visión artificial: actualización de la tecnología disponible y experiencia personal
Dr. Paulo Stanga
Manchester Royal Eve Hospital> Manchester Central y Manchester Children's University Hospitals, Gran Bretaña.
Con la ayuda de avances tecnológicos se han desarrollado nuevas prótesis que permiten un cierto grado de visión en pacientes ciegos. Se han implementado prótesis esclerales o epirretinales cuyos resultados muy promisorios— se publicaron recientemente en revistas internacionales. Nuevas posibilidades, impensables hace pocos años, surgen actualmente para el tratamiento de la ceguera.
Electronic retinal prostbesis for artificial vision: update on available technology and personal experience
With the aid of technological breakthrough, new prostheses offering blind patients a limited degree of vision have been developed. Scleral or epiretinal prostheses have been implemented, the —very promising— results of which have been published recently in international journals.
New possibilities that were unthinkable a few years ago, are currently emerging for the treatment of blindness.
Prótese retiniana eletránica para visáo artifi cial: atualizaráo da tecnologia thyonivel e expenencta pessoal
Com a ajuda dos avangos tecnológicos foram desenvolvidas novas próteses que permitem um determi-nado grau de visáo nos pacientes cegos. Implementaram-se próteses esclerais epirretinianas cujos resultados —muito promissórios— foram publicados recentemente em revistas internacionais. Novas possibilidades, impensáveis alguns anos atrás, surgem na atualídade para o tratamento da cegueira.
INVESTIGACIONES PRESENTADAS / RESEARCH PAPERS PRESENTED/ PESQUISAS APRESENTADAS
Modelo experimental de queratitis inducida por láser de argón en cobayos
Monti Ra, Suárez MFa, Benatti Ac, Espósito Ea, Correa La,Crim Na, Urrets Zavalia JAa, Serra HMb
aCentro de la Visión, Clínica Universitaria Reina Fabiola, Universidad Católica de Córdoba.
bCIBICI-CONICET, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.
cClínica de Ojos de Córdoba.
fitomonti@hotmail.com; mfsuarez10@gmail.com
Objetivo. Provocar lesiones reproducibles en epitelio y estroma superficial de córnea de cobayos utilizando láser de argón y evaluar el proceso de recuperación mediante biomicroscopia (BM) y tomografia de coherencia óptica (OCT).
Métodos. Se utilizaron cobayos pigmentados siguiendo las normas para cuidado de animales de ARVO. Erosiones: se empleó láser de argón de uso oftalmológico (Novas 2000, Coherent), utilizado con su montaje en lámpara de hendidura. Algunos ojos no fueron tratados (control, n=2) y otros recibieron 7 disparos focalizados sobre el epitelio corneal central con diferentes potencias (500, 400, 350, 300, 150 y 100 mW) con un tiempo de exposición y tamaño de disparo constantes (n=2) para cada condición. Se controlaron las alteraciones cornea-les inducidas mediante BM (Haag Streit 900) y OCT (Visante y Cirrus, Carl Zeiss) a los siguientes tiempos: 1 hora, 14 horas, 7 días, 14 días y 21 días.
Resultados. En los controles efectuados por BM se observó la presencia de leucomas cuya persistencia en el tiempo se correlacionó con la potencia de láser empleada. Con 500, 400 y 350 mW los leucomas se registraron hasta el día 21 de control. Con 300 y 150 mW los leucomas desaparecieron hacia el día 7, y con 100 mW a las 14 horas ya no se observaron leucomas. Mediante OCT se observó un adelgazamiento del espesor corneal en los animales tratados con respecto del control [35% a 500 mW, 36% a 400 mW, 6% a 350 mW (7 disparos), 11% a 350 mW (15 disparos), 17% a 300 mW, 4% a 150 mW y 7% a 100 mW] . Una completa recuperación del espesor corneal se observó a los 7 días.
Conclusiones. Fue posible desarrollar lesiones corneales de epitelio y estroma anterior de manera reproducible. El espesor corneal se redujo de manera proporcional a la intensidad del láser y los leucomas se observaron fundamentalmente cuando se utilizaron altas intensidades. Las córneas se recuperaron en todos los casos en una semana.
Subsidios. SECYT UNC, CONICET PIP; FONCYT PICT.
An experimental model of argon-laser induced keratitis in guinea pigs
Objective. To generate reproducible lesions in the corneal epithelium and superficial stroma of guinea pigs using argon laser and evaluare the recovery process by means of biomicroscopy (BM) and Optical Coherence Tomography (OCT).
Methods. Pigmented guinea pigs were used according to ARVO guidelines for animal research. Erosions: an argon laser device (Novus 2000, Coherent) for ophthalmic practices, mounted on a slit lamp, was used. Some eyes were left untreated (control, n= 2) and others received 7 shots directed at the central corneal epithelium at different powers (500, 400, 350, 300, 150 and 100 mW) and with constant exposure time and shot size (n = 2) for each condition. Induced corneal alterations induced were controlled by BM (Haag Streit 900) and OCT (Visante & Cirrus, Carl Zeiss) at the following time-points: 1 hour, 14 hours, 7 days, 14 days and 21 days.
Results. Controls by BM revealed the presence of leukomas, the time persistente of which had a correlation with the laser power used. At 500, 400 and 350 mW, leukomas had disappeared by day 7, and at a power of 100 mW of power, there were no leukomas at 14 hours. OCT revealed corneal thickness thinning ín animals treated vs. controls [35% at 500 mW, 36% at 400 mW, 6% at 350 mW (7 shots), 11% at 350 mW (15 shots), 17% at 300 mW, 4% at 150 mW and 7% at 100 mW]. Full recovery of corneal thickness was observed on day 7.
Conclusions. We were able to develop reproducible corneal lesions of the anterior epithelium and stroma.
The corneal thickness reduction was proporcional to the laser intensity and leukomas were observed mainly at high power. All corneas had recovered in all cases within one week.
Supports: SECYT UNC, CONICET PIP; FON-CYT PICT
Modelo experimental de ceratite induzida por laser árgon em cobaias
Objetivo. Provocar lesóes reproduzíveis no epitélio e estroma superficial da córnea de cobaias utilizando laser de argónio e avahar o processo de recuperaçao mediante biomicroscopía (BM) e tomografia de coeréncia óptica (OCT).
Métodos. Foram utilizadas cobaias pigmentadas seguindo as normas para cuidado de animais da ARVO. Erosóes: foi usado laser de argónio para uso oftálmico (Novus 2000, Coherent), utilizado com sua montagem em lámpada de fenda. Alguns olhos náo foram tratados (controle, n=2) e outros receberam sete disparos focalizados sobre o epitélio corneano central com diferentes potencias (500, 400, 350, 300, 150 e 100 mW) com um tempo de exposiçao e tamanho de disparo constantes (n=2) para cada condigo. Foram controladas as alteracóes corneanas induzidas mediante BM (Haag Streit 900) e OCT (Visante e Cirrus, Carl Zeiss) nos seguintes tempos: 1 hora, 14 horas, sete días, 14 dias e 21 dias.
Resultados. Nos controles realizados por BM observou-se a preseng de leucomas cuja persistencia no tempo foi correlacionada com a potencia de laser empregada. Com 500, 400 e 350 mW os leucomas foram registrados até o dia 21 de controle. Com 300 e 150 mW, os leucomas desapareceram por volta do dia 7, e com 100 mW ás 14 horas já náo foram observados leucomas. Mediante OCT foi possível ver um afinamento da espessura corneana nos anímais tratados a respeito do controle [35% a 500 mW, 36% a 400 mW, 6% a 350 mW (7 disparos), 11% a 350 mW (15 disparos), 17% a 300 mW, 4% a 150 mW e 7% a 100 mW]. Urna completa recuperacá.o da espessura corneana foi observada aos sete dias.
Conclusóes. Foi possível desenvolver lesóes corneanas de epitélio e estroma anterior de forma reproduzível. A espessura corneana reduziu-se de forma proporcional á intensidade do laser e os leucomas foram observados fundamentalmente guando utilizadas altas intensidades.
As córneas foram recuperadas em todos os casos em urna semana
Subsidios. SECYT UNC, CONICET PIP; FON-CYT PICT.
Queratitis fototérmica en cobayos inducida por diferentes tipos de láseres
Crim Na, Monti Ra, Espósito Ea, Correa La, Sambuelli Suárez MRa, Serra HMc, Urrets Zavalía JAa
aServicio de Oftalmología, Clínica Universitaria Reina Fabiola, Universidad Católica de Córdoba.
bServicio de Anatomía Patológica, Clínica Universitaria Reina Fabiola, Universidad Católica de Córdoba.
cCIBICI-CONICET, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.
nicolascrimohotmail.com
Objetivo. Evaluar la lesión corneal producida por diferentes láseres en los ojos de cobayos para aproximarse a un modelo animal experimental de queratitis fototérrnica.
Material y métodos. Se utilizaron cobayos pigmentados siguiendo las normas para cuidado de animales de ARVO. Los animales fueron divididos en 4 grupos experimentales n=2 y uno control. Cada grupo experimental fue tratado con distintos tipos de láseres. El grupo 1 con láser de argón (G1-A), grupo 2 con láser dióxido de carbono (G2-0O2), grupo 3 con láser diodo (G3-Di) y el grupo 4 con láser Nd-Yag (G4-NY). Los animales fueron anestesiados con xilacina 50 mg/ kg (subcutánea) y con proparacaína (tópica ocular) y sus córneas expuestas a distintas intensidades de cada uno de los láseres.
Los daños provocados fueron evaluados mediante biomicroscopía (BMC) y una hora después de la lesión corneal se procedió a eutanasia de los animales utilizando xilacina intracardíaca a dosis de 100 mg/kg.
Las córneas fueron extraídas y estudiadas mediante microscopia óptica (MO) con tinción de hematoxilinaeosina (HE).
Resultados. LA BMC reflejó evidencia de erosiones superficiales y úlceras según el láser y la potencia utilizada. En la anatomía patológica se evidenció daño de todas las capas de la córnea (desde el epitelio corneal hasta endotelio) con todos los láseres y disparos, excepto en el Gl-Al, donde se preservó el endotelio corneal.
Conclusiones. Solo en G1-Al se produjo un daño que no alteraba configuración del endotelio corneal, siendo alterado el epitelio y el estroma medio y anterior, donde se produjo un haz de impacto 24.05 ± 12.02 micras. Es necesario aumentar el número de ojos para confirmar la reproducción del daño corneal.
Subsidios. SECYT, UNC.
Photothermal keratitis induced by different laers in guinea pigs
Objective. To evaluare corneal injuries caused by different lasers in guinea pig eyes in an attempt to achieve an experimental animal model pf photothermal keratitis.
Material and methods. Pigrnented guinea pigs were used according to the ARVO guidelines for animal research. Animals were divided inca 4 experimental groups (n= 2) and one control group. Each experimental group was treated with different types of lasers. Group 1 received treatment with argon laser (G1-A), group 2, with carbon dioxide laser (G2-0O2), group 3 was treated with diode laser (G3-Di) and graup 4, with Nd-Yag laser (G4-NY). Animals were anesthetized with xylazine (50 mg/kg, administered subcutaneously) and with proparacaine (topical eyedrops) and their corneas were exposed at different intensities for each laser type.
Damage caused was evaluated by biomicroscopy (BMC) and the guinea pigs were euthanized using intracardiac xylazine at doses of 100 mg/kg one hour after the corneal ínjury was induced.
The corneas were removed and studied by optical microscopy (OM) usíng hemataxylineasin (HE) staining.
Results. BMC evidenced the presence of superficial erosions and ulcers accarding ro the laser and power used. Pathologic anatomy revealed damage to all the corneal layers (from the corneal epithelium to the endothelium) with all lasers and shots, except for Gl-Al, with which the corneal endothelium was preserved.
Conclusions. Only in G1-Al the damage caused did not alter the configurarían of the corneal endothelium, but there was alteration of the epithelium and medium and anterior stroma, where the beam produced an impact of 24.05 ±12.02 microns. A greater number of eyes is needed to confirm the reproduction of corneal damage.
Supports. SECYT, UNC.
Ceratite fototérmica em cobaias induzida por diferentes tipos de laser
Objetivo. Avahar a lesáo corneana produzida por diferentes tipos de laser nos olhos de cobaias para aproximar-se a um modelo animal experimental de ceratite fototérmica.
Materiais e métodos. Foram utilizadas cobaias pigmentadas seguindo as normas para o cuidado dos animais ARVO. Os animais foram divididas em 4 grupos experimentais n=2 e um controle. Cada grupo experimental foi tratado com diferentes tipos de laser. O grupo 1 com laser de argónio (G1-A), grupo 2 com laser dióxido de carbono (G2-0O2), grupo 3 com laser diodo (G3-Di) e o grupo 4 com laser Nd-Yag (G4- NY). Os animais foram anestesiados com xilazina 50 mg/kg (subcutánea) e com propacaína (tópica ocular) e suas córneas faram expostas a diferentes intensidades de cada um dos laser.
Os danos provocados foram avaliados mediante biomicroscopia (BMC) e uma hora depois da lesáo corneana foi realizada eutanasia dos animais utilizando xilazina por via intracardíaca em doses de 100 mg/kg.
As córneas foram extraídas e estudadas mediante microscopia óptica (MO) com colorado hematoxílinaeosina (HE).
Resultados. A BMC mostrou evidencia de erasóes superficiais e úlceras segundo o laser e a poténcia utilizada.
Na anatomia patológica foi evidente o dano de todas as camadas da córnea (desde o epitélio corneano até o endotélio) com todos os laser e disparos, exceto no Gl-Al, onde o endotélio corneano foi preservado.
Conclusóes. Apenas em G1 -Al foi produzido um dano que nio alterava a configurayáo do endotélio corneano, mas provacou alteraçoes no epitélio e no estroma media e anterior ande apresentou-se um feixe de impacto 24.05 t 12.02 micra. É preciso aumentar o número de Alas para confirmar a repraducáo do dano da córnea.
Subsidios. SECYT, UNC.
Citocinas y gelatinasas de epitelio corneal en queratopatía climática
Serra HMa, Suárez MFa, Robciue Ab, Holopainen Jb, Urrets Zavalía JAc
aCISICI-CONICET, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.
bHelsinki EyeLab, Department of Opluhalmology, University of Helsinki, Helsinki, Finland;
cCentro de la Visión, Clínica Universitaria Reina Fabiola, Universidad Católica de Córdoba
hserraomail.fcq.unc.edu.ar
Objetivo. La queratopatía climática (QPC) es una enfermedad degenerativa de la córnea caracterizada por un opacificación progresiva que se produce en individuos expuestos a altos niveles de irradiación ultravioleta B (RUV-B). Hemos demostrado previamente un aumento en gelatinasas y citoquinas proinflamatorias en lágrimas de estos pacientes. En este estudio investigamos la expresión de MMP-2 y 9 en biopsias de QPC y los efectos de RUV-B sobre células epiteliales corneales humanas (ECH).
Metodología. Se tiñeron las córneas de pacientes afectados con QPC y una córnea normal con hematoxilina-eosina, y la presencia y distribución de MMP-2 y MMP-9 se examinó utilizando inmunohistoquímica. Secreción de gelatinasas y citocinas se midió en sobrenadante de las células ECH luego de haberlas expuesto a radiación RUV-B, utilizando inmunotransferencia, zimografía y arreglo de proteínas.
Resultados. Los estudios de inmunohistoquímica mostraron que MMP-2 se expresó en la membrana basal en el control y córneas afectadas, pero también marcadamente en los bordes de los depósitos granulares de QPC. La expresión de MMP-9 estuvo restringida a las capas basales del epitelio y se indujo notablemente en las córneas con QPC. La exposición de células de ECH a UVB aumentó la secreción de gelatinasas con un efecto sorprendente sobre la MMP-9 y fue precedida por la liberación de citocinas proinflamatorias.
Conclusión. Se demuestra que el epitelio corneal podría participar en el desarrollo de QPC como fuente de citocinas y gelatinasas. Además, en las células de ECH, la radiación UVB modula citoquinas y la posterior secreción de MMP. La inhibición local de la secreción de citoquinas y gelatinasas podría prevenir la progresión de QPC.
Subsidios. SECYT UNC; CONICET PIP; FON-CYT PICT.
Cytokines and gelatinases from correal epithelium in climatic dropkt keratopathy
Objective. Climatic droplet keratopathy (CDK) is a degenerative disease of the cornea characterized by veiling, which occurs in individuals exposed to high levels of ultraviolet B (UVB) radiation. We have previously demonstrated an increase in proinflammatory gelatinases and cytokines in the tears of these patients. In this study we have investigated MMP-2 and MMP-9 expression in biopsies of CDK and the effects of UVB radiation on human corneal epithelial (HCE) cells.
Methodology. The corneas of CDK patients and a normal cornea were hematoxylin-eosin stained and the presence and distribution of MMP-2 and MMP-9 were examined using immunohistochemistry. Gelatinase and cytokine secretion was measured in tears and supernatant from HCE cells after exposure to UVB radiation by immunotransfer, zymography and protein arrangement.
Results. Immunohistochemistry evidenced that MMP-2 was expressed at the basement membrane in both control and affected corneas, but also markedly at the eriges of the granular CDK deposits. MMP-9 expression was restrained to basal layers of the epithelium and was markedly induced in CDK corneas. Exposure of HCE cells to UVB radiation increased gelatinase secretion, with a striking effect on MMP-9, and was preceded by pro-inflammatory cytokine release.
Conclusion. We have demonstrated that the corneal epithelium might have a role in the development of CDK as a source of cytokines and gelatinases. Addi¬tionally, in HCE cells, LIVE radiation modulares cytokine and subsequent MMP secretion. Local inhibition of cytokine and gelatinase secretion may prevent CDK progression.
Supports. SECYT UNC; CONICET PIP; FON-CYT PICT.
Citocinas e gelatinases do epitélio Corneano em ceratopatia climática
Objetivo. A ceratopatia climática (QPC) é urna doenca degenerativa da córnea caraterizada por urna opacificao progressiva produzida em individuos expostos a altos niveis de irradiaclo ultravioleta B (RUV-B). Ternos demonstrado previamente um aumento das gelatinases e citocinas pro-inflamatórias em lágrimas desses pacientes. Neste estudo pesquisamos a expressáo de MMP-2 e 9 em biopsias de ceratopatia climática (QPC) e os efeitos de RUV-B sobre células epiteliais corneanas humanas (ECH).
Metodología. Foram coloreadas as córneas de pacientes afetados com ceratopatia climática e urna córnea normal com hematoxilina-eosina, e a presenca e distribuicáo de MMP-2 e MMP-9 foi examinada utilizando imuno-histoquímica. A secreto de gelatinases e citocinas foi medida em sobrenadante das células epiteliais corneanas humanas depois de ter sido expostas radiacáo RUV-B, utilizando imunotransferéncia, zimografia e arranjo de proteínas.
Resultados. Os estudos de imuno-histoquímica mostraram que o MMP-2 expressou-se na membrana basal no controle e nas córneas afetadas, mas também significativamente nas bordas dos depósitos granulares de ceratopatia climática. A expressáo de MMP-9 foi restrita ás camadas basais do epitélio e induzida notavelmente nas córneas com ceratopatia climática. A exposicáo de células epiteliais corneanas humanas aos LTVB aumentou a secrecáo de gelatinases com um efeito surpreendente sobre a MMP-9 e foi precedida pela liberacáo de citocinas pró-inflamatórias.
Conclusóes. Demonstra-se que o epitélio corneano poderia participar no desenvolvimento da ceratopatia climática como fonte de citocinas e gelatinases. Além disso, nas células epiteliais corneanas humanas, a ra-diaáo LTVB modula citocinas e a posterior secreçao de MMP. A inibicáo local da secreçao de citocinas e gelatinases poderia prevenir a progressáo da ceratopatia climática.
Subsidios. SECYT UNC; CONICET PIP; FON-CYT PICT.
Nuevo ciclo visual en la retina interna de pollo
Díaz NMa, Verra DMa, Valdez DJa, Betts BSb, Tsin ATb, Guido MEa
aCIQUISIC-CONICET, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Gárdoba.
bBiology, University of Texas at San Antonio, San Antonio, Texas.
Antecedentes. Previamente reportamos que los pollos GUCY 1, modelo aviar de la amaurosis congénita de Leber, presentaban respuestas a la luz mediada por la retina interna aun en ausencia de conos y bastones funcionales; respuestas presumiblemente mediadas por células ganglionares intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs) que expresan el fotopigmento melanopsina. Los fotopigmentos no visuales responsables de tal fotosensibilidad podrían utilizar un ciclo visual de regeneración del cromóforo independiente de la capacidad de biestabilidad.
Objetivo. Nuestro estudio se enfoca en investigar el ciclo de regeneración que puede tener lugar en las ipR-GCs. Para esto investigamos la expresión y la actividad enzimática de diferentes enzimas involucradas con el ciclo visual clásico de regeneración del cromóforo en la retina interna de pollos WT.
Métodos. Pollos WT jóvenes adaptados a oscuridad fueron expuestos a 30 m de luz o mantenidos en oscuridad y sacrificados en luz roja tenue. Los ojos fueron diseccionados y liofilizados, y las diferentes capas de la retina fueron obtenidas por el método de cinta Scotch. Las muestras se procesaron para extracción de ARN, RT-PCR, inmunohistoquímica. Los retinoides fueron extraídos y medidos por HPLC.
Resultados. Los niveles de 11-cis retinal (RAL) fue-ron más altos en las capas de RGCs y nuclear interna en condiciones de luz respecto de oscuridad, mientras que los fotorreceptores presentaron un comportamiento opuesto y esperado para este tipo de células. Para identificar el origen del aumento de 11-cis RAL en presencia de la luz estudiamos la proteína fotoisomerasa RGR, la cual posee la capacidad de generar 11cis RAL a partir de All-trans RAL en presencia de luz. RGR se expresa a lo ancho de la retina, presentando una marca intensa en la capa de células ganglionares. RGR colocalizó con marcadores específicos de células gliales de Müller. También se estudió la actividad de las enzimas ARAT e isomerasa II, las cuales participan en la regeneración del cromóforo en las células de Müller. Se encontró actividad ARAT en todas las capas de la retina, mientras que la actividad isomerasa II se localizó en fotorreceptores y capa nuclear interna.
Conclusión. Estos resultados nos sugieren que RGR podría participar en la regeneración del cromóforo 11-cis RAL en condiciones de exposición a la luz, dando así lugar a un nuevo ciclo visual de la retina interna del pollo.
Subsidios. FONCyT (PICT 2004 no. 967 y PICT Bicentenario 2010 no. 647), CONICET, SeCyT¬UNC, MinCyT de Córdoba.
A novel visual cycle in the inner retina of chickens
Background. We have previously reported that GUCY 1 chickens, an avian model of Leber congenital arnaurosis, had inner retina-mediated light responses even in the absence of functional rods and cones. These responses are presumably mediated by intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs) that express the photopigment melanopsin. Non-visual photopigments responsible for such photosensitivity might use a visual cycle of chromophore regeneration independent of biostability capacity.
Objective. Our study focuses on the investigation of the regeneration cycle that can take place in ipRGCs. For such purpose, we have investigated the expression and enzymatic activity of different enzymes involved in the classical visual cycle of chromophore regeneration in the inner retina of wild-type (WT) chickens.
Methods. Dark-adapted young WT chickens were exposed to 30 min of light or kept in the dark and euthanized under dim red light. Eyes were dissected and lyophilized and the different retinal layers were obtained using the Scotch tape method. Samples were processed for RNA extraction, RT-PCR and immuno-histochemistry. Retinoids extracted were analyzed by HPLC.
Results. 11-cis-retinal (RAL) levels were higher in the RGCs and inner nuclear layers under light vs. dark conditions, while photoreceptors elicited the opposite behavior, which was expected for Chis type of cells. In arder to identify the origin of 11-cis RAL increased levels in the presence of light, we have studied the photoisomerase retinal G-protein-coupled receptor (RGR), whích has the ability to generare 11-cis-RAL from all-trans-RAL in the presence of light. The RGR is expressed across the retina, with an intense mark in the ganglion cell layer. RGRs colocalized with specific markers for Müller glial cells. We also studied the activity of ARAT enzymes and isomerase II, which have a role in chromophore regeneration of Müller cells. All retinal layers evidenced ARAT activity, while isomerase II activity was localized in photoreceptors and inner nuclear layer.
Conclusion. These results suggest that RGRs might have a role in chromophore 11-cis RAL regeneration under conditions of light exposure, thereby originating a new visual cycle of the inner retina of chickens.
Supports. FONCyT (PICT 2004 no. 967 and PICT Bicentenario 2010 no. 647), CONICET, SeCyT-USNC, MinCyT of Córdoba.
Novo ciclo visual na retina interna do frango
Antecedentes. Previamente relatamos que os frangos GUCY 1, modelo aviário da amaurose congénita de Leber, apresentavam respostas á luz mediada pela retina interna mesmo em ausencia de cones e bastonetes funcionais; respostas presumivelmen te mediadas por células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs) que expressam o fotopigmento melanopsina. Os fotopigmentos náo visuais responsáveis dessa fotosensibilidade poderiam utilizar um ciclo visual de regeneragáo do cromóforo independente da capacidade de biestabilidade.
Objetivo. Nosso escudo é focado na pesquisa do ciclo de regenernáo que pode ocorrer nas ipRGCs. Para isso, pesquisamos a expressáo e a atividade enzimática de diferentes enzimas envolvidas no ciclo visual clássico de regeneraglo do cromóforo na retina interna de frangos WT.
Métodos. Frangos WT jovens adaptados á escuridáo foram expostos a 30 m de luz ou mantidos na escuridáo e sacrificados sob luz vermelha tenue. Os olhos foram dissecados e liofilizados e as diferentes camadas da retina foram obridas pelo método de fita adesiva Scotch. As amostras foram processadas para extragáo de ARN, RT-PCR, imuno-histoquímica. Os retinóides foram removidos e medidos por HPLC.
Resultados. Os níveis de 11-cis retinal (RAL) foram mais altos nas camadas de RGCs e na carnada nuclear interna em condiçoes de luz a respeito da escuridáo enquanto, os fotorreceptores apresentaram um comporramento oposto e esperado para esse tipo de células. Para identificar a origem do aumento de 11-cis RAL em presenga da luz estudamos a proteína fotoisomerasa RGR, a qual possui a capacidade de gerar 11-cis RAL a partir de All-trans RAL em presença de luz. RGR se expressa ao largo da retina, apresentando uma marca intensa na carnada de células ganglionares. RGR colocalizou com marcadores específicos de células gliais de Müller. Também foi escudada a atividade das enzimas ARAT e isomerase II, as quais participara na regeneragáo do cromóforo nas células de Müller. Foi encontrada atividade ARAT em todas as camadas da retina, enquanto a atividade isomerase II foi localizada em fotorreceptores e na carnada nuclear interna.
Conclusóes. Esses resultados sugerem que RGR poderia participar na regeneragáo do cromóforo 11-cis RAL em condiglies de exposigáo á luz, possibilitando, assim, um novo ciclo visual da retina interna do frango.
Subsidios. FONCyT (PICT 2004 no. 967 y PICT Bicentenario 2010 no. 647), CONICET, SeCyT-UNC, MinCyT de Córdoba
Cultivos primarios de retina de pollo altamente enriquecidos en células horizontales expresan el fotopigmento melanopsina X
Morera LP, Díaz NM, Guido ME
CIQUIBIC-CONICET, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.
Luis.p.morera @gmial com
Antecedentes. Las células ganglionares de la retina (CGR) que expresan el fotopigmento melanopsina (OPN4) son intrínsecamente fotosensibles. En la retina de pollo han sido descriptos dos genes de OPN4, Opn4x y Opn4m. Se demostró que la expresión de Opn4m se limita solo a la capa de GCRs, mientras que Opn4x cambia a lo largo del desarrollo: al día embrionario 8 (E8) se limita a la capa en formación de CGRs y al nervio óptico, mientras que a partir del El5 aparece principalmente en células horizontales (HC).
Objetivos. El propósito de este trabajo fue purificar las HC de la retina de pollo, obtener cultivos primarios altamente enriquecidos en estas células y caracterizarlos.
Métodos. Se disgregaron retinas de embriones de pollo de E15 y se sometieron a un gradiente discontinuo de 1 al 4% de albúmina de suero bovino (BSA). Las células recolectadas de las diferentes fases se cultivaron durante 4 días y se caracterizaron por inmunoquímica y morfología celular. Las fases se examinaron con anticuerpos específicos contra Opn4x, marcadores de HC (Prox-1, Islet- 1, calretinina) y marcadores para otras poblaciones de células de la retina. Además la expresión de Prox-1 en la retina se determinó por citometría de flujo. Finalmente los cultivos primarios fueron analizados por RT-PCR.
Resultados. Sólo la fracción del gradiente correspondiente al 2,5% de BSA contuvo el mayor porcentaje de HC. Basados en un detallado análisis morfológico se encontró que las células de esta fracción se asemejan a HC tipo Hl y H3. La inmunorreactividad de Opn4x se observó en los cultivos de las células provenientes tanto de la fase 2,5 como de la del 3% de BSA. Es de destacar que la fase 3% contiene células que expresan el filamento neuronal 200 kDa (NF200) y presentan procesos que se asemejan morfológicamente a los de las CGR. El análisis por citometría de flujo demostró que un 30% de las células en el disgregado de retina total y un 80% de las células de la fase 2,5% presentan marca Prox-1 (+). El análisis por RT-PCR evidenció la presencia de transcriptos correspondientes a marcadores específicos de HC.
Conclusiones. Por medio de este método separamos selectivamente HC y logramos cultivos altamente enriquecidos en estas células que expresan el fotopigmento OPN4x.
Subsidios. ANPCyT-FONCyT PICT Bicentenario 2010 no. 647, PICT, CONICET, SeCyT-UNC y MinCyT de Córdoba.
Highly enriched primary cultures of chicken retinal horizontal cells express the photopigment melanopsin X
Background. Retinal glanglion cells (RGCs) expressing the photopigment melanopsin (OPN4) are intrinsically photosensitive. Two OPN2 genes, opn4x and Opn4m, have been described ín the chicken retina. Ir has been demonstrated that the expression of Opn4m is restricted to the RGC layer, while Opn4x changes throughout development: on embryonic day 8 (E8) it is limited to the RGC layer in formation and to the optic nerve, while as from E15 it appears mainly in horizontal cells (HCs).
Objectives. The purpose of this paper was to purify HCs from the chicken retina, obtain highly enriched primary cultures in these cells and characterize them.
Methods. Embryonic chicken retinas at E15 were disaggregated and subjected to a discontinuous 1 to 4% bovine serum albumin (BSA) gradient. Cells from the different phases were cultured for 4 days and characterized by immunohistochemistry and cell morphology. Phases were examined with Opn4x-specific antibodies, HC markers (Prox-1, Islet-1, calretinin) and markers for other retina' cell populations. In addition, Prox-1 expression in the retina was determined by flow cytometry. Finally, primary cultures were analyzed by RT-PCR.
Results. Only the 2.5% BSA gradient phase contained the greatest percentage of HCs. Based on a de-tailed morphological analysis, it was found that cells from this fraction are similar to HCs type Hl and H3. Opn4x immunoreactivity was observed in cultures of cells from both the 2.5 and 3% BSA gradient phases. Strikingly, the 3% phase contains cells that express the neuronal filament 200 kDa (NF200) and present processes that morphologically resemble those of RGCs. Flow cytometric analysis revealed that 30% of cells from the whole disaggregated retina and 80% from the 2.5% BSA gradient phase cells were Prox-1(+). RT-PCR analysis evidenced the presence of transcripts corresponding to HC-specific rnarkers.
Conclusions. By this method we have been able to selectively separate HCs and to obtain highly enriched cultures in these cells that express the OPN4x photo pigment.
Supports. AN PCyT- FON CyT PICT Bicentenario 2010 no. 647, PICT, CONICET, SeCyT-UNC and MinCyT of Cordoba.
Culturas primárias de retina de frango altamente enriquecidas em células horizontais ex-pressam o fotopigmento melanopsina X
Antecedentes. As células ganglionares da retina (CGR) que expressam o fotopigmento melanopsina (OPN4) sáo intrinsecamen te fotossensíveis. Na retina do frango tem sido descritos dais genes de OPN4, Opn4x e Opn4m. Foi demonstrado que a expressáo de Opn4m limita-se apenas á carnada de GCRs, enquanto Opn4x muda ao longo do desenvolvimento: até o dia embrionario oito (ES) limita-se á carnada em formagáo de CGRs e ao nervo óptico, enquanto, a partir do E15 aparece principalmente em células horizontais (HC).
Objetivos. O propósito deste trabalho foi purificar as células horizontais (HC) da retina do frango, obter culturas primárias altamente enriquecidas nestas células e caracterizó-los.
Métodos. Retinas de embrióes de frango de E15 foram desagregadas e submetidas a um gradiente descontinuo de 1 a 4%de albumina de soro bovino (BSA). As células toleradas das diferentes fases foram cultivadas durante 4 dias e caracterizaram-se por imunoquímica e morfologia celular. As fases foram examinadas com anticorpos específicos contra Opn4x, marcadores de HC (Prox-1, Islet-1, calretinina) e marcadores para outras populaOes de células da re-tina. Além disso, a expressáo de Prox-1 na retina foi determinada por citometria de fluxo. Finalmente as culturas primárías foram analisadas por RT-PCR
Resultados. Apenas a fracáo do gradiente correspondente a 2,5% de BSA conteve a majar percentagem de HC. Baseados em uma detalhada analise morfológica, encontrou-se que as células dessa fragáo sáo semelhantes a HC tipo Hl e H3. A imunorreatividade de Opn4x foi observada nas culturas das células provenientes tanto da fase 2,5 quanto da fase de 3% de BSA. Convém destacar que a fase 3% contém células que expressam o filamento neuronal 200 kDa (NF200) e apresentam processos semelhantes morfologicamente aos das CGR. A análise por citometria de fluxo demonstrou que um 30% das células na desagregacáo da retina total e 80% das células da fase 2,5% apresentam marca Prox-1 (+). A análise por RT-PCR evidenciou a presenca de transcritos correspondentes a marcadores específicos de HC.
Conclusóes. Por meio desse método separamos seletivamente HC e conseguimos culturas altamente enriquecidas nessas células que expressam o fotopigmento OPN4x.
Subsidios. ANPCyT-FONCyT PICT Bicentenario 2010 no. 647, PICT, CONICET, SeCyT-UNC e MinCyT de Córdoba.
Preservación del sistema visual no formador de imágenes en la diabetes tipo experimental en ratas
Sande PH, Fernández DC, Zavalía N, Belforte N, Dorfman D, Rosenstein RE
Departamento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, CEFyBO-CONICET.
p_sande@yahoo.com
Objetivos. Examinar el sistema visual no formador de imágenes en una etapa avanzada de diabetes experimental en ratas.
Métodos. Se inyectó estreptozotocina (60 mg/kg) o vehículo en ratas Wistar macho adultas. Un grupo de animales se sometió a lensectomía (remoción del cristalino) bilateral. Se evaluó la función retinal (electrorretinograma, ERG) y de la vía visual (potenciales visuales evocados, PVE), el número de células ganglionares y melanopsina(+) (inmunohistoquímica de Brn3a y melanopsina) y los niveles de melanopsina (western blot). Se examinó el transporte anterógrado de la subunidad beta de la toxina del cólera al colículo superior (CS), los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) y el núcleo pretectal olivar (NPO). Se determinó el reflejo pupilar (1200 lux por 30 s) y la inducción de c-fos en los NSQ (por inmunohistoquímica). Se registraron ritmos diarios de actividad locomotora.
Resultados. A las 15 semanas de diabetes, el ERG y los PVE disminuyeron significativamente y todos los animales desarrollaron cataratas maduras. El número de células Brn3a(+) y las proyecciones al CS disminuyeron significativamente, pero no se observaron
diferencias en el número de células melanopsina(+), en los niveles de melanopsina y en las proyecciones retinales a los NSQ y al NPO. El reflejo pupilar aferente se conservó luego de 10 semanas de diabetes. A las 15 semanas de diabetes disminuyó la expresión de c-Fos en los NSQ inducida por luz. En los animales diabéticos se conservó el ritmo diario de actividad locomotora, aunque se observó un aumento en el tiempo necesario para la resincronización luego de un retraso de fase (4 horas). La lensectomía revirtió significativamente la reducción en la expresión de c-Fos y en la resincronización del ritmo de actividad locomotora inducida por diabetes.
Conclusión. Estos resultados sugieren que el sustrato neuronal de sistema visual no formador de imágenes se preserva en etapas avanzadas de diabetes y que la lensectomía podría restaurar las alteraciones ciscadianas inducidas por diabetes experimental.
Subsidios. ANPCyT, UBA, CONICET.
Non-image-forming visual system preservation in experimental type I diabetes in rats
Objectives.To examine the non-image-forming visual system in an advanced stage of experimental diabetes in rats.
Methods. Streprozotozin (GO mg/kg) or vehicle was injecred ro adulr male Wistar rats. A group of these rats underwent bilateral lensectomy (crystalline lens removal). Retinal (electroretinogram, ERG) and visual parhway (visual evoked potentials, VEP) function, number of ganglion cells and of melanopsin(+) cells (Brn3a immunohistochemistry and melanopsin) and melanopsin levels (Western bloc) were examined. Anterograde transpon of the cholera toxin beta subunit to the superior colliculus (SC), suprachiasmatic nuclei (SCN) and olivary pretectal nudeus (OPN) was assessed. The pupillary light reflex (1200 lux per 30 sec) and c-Fos induction in the SCN (by immunohistochemistry) were determined. Circadian locomotor activity rhythms were recorded.
Results. Afrer 15 weeks of diabetes induction, ERG and VEP had decreased significantly and all rats had developed mature cataract. The number of Brn3a(+) cells and projections to the SC were reduced significantly, but no differences were found in the number of melanopsin(+) cells, melanopsin levels and retinal projections ro the SCN and OPN. The afferenr pupillary reflex was conserved after 10 weeks of diabetes. After 15 weeks of diabetes, light-induced c-Fos expression in the SCN had decreased. In diabetic anirnals, the circadian rhythm of locomotor activity was conserved, rhough there was an increase in the time needed to re-entrainment after a phase delay (4 hours). Lensectomy significantly reversed the diabetes-induced reduction in c-Fos expression and in re-entrainment to the locomotor activity rhythm.
Conclusion. These results suggest that the neuronal substrate of the non-image forming visual system is preserved at advanced stages of diabetes and that lensectomy could resrore circadian alterations induced by experimental diabetes.
Supports. ANPCyT, UBA, CONICET.
Preservaçáo do sistema visual náo formador de imagens na diabete tipo 1 experimental em ratos
Objetivos. Examinar o sistema visual náo formador de imagens numa etapa avanoda de diabete experimental em ratos.
Métodos. Foi injetada estreptozotocina (GO mg/kg) ou veículo em ratos Wistar macho adultos. Um grupo de amimais foi submetido a lensectomia (remçao do cristalino) bilateral. Foi avaliada a fungáo da retina (eletrorretinograma, ERG) e da via visual (potenciais visuais evocados, PVE), o número de células ganglionares e melanopsina(+) (imuno-hisroquímica de Brn3a e melanopsina) e os níveis de melanopsina (western blot). Foi examinado o transporte anterógrado da subunidade beta da toxina da cólera ao colículo superior (CS), os núcleos supraquiasmaricos (NSQ) e o núcleo pretectal olivar (NPO). Foi determinado o reflexo pupilar (1200 lux por 30 s) e a indtwáo de c-fos nos NSQ (por imuno-histoquímica). Foram registrados ritmos diarios de atividade locomotora.
Resultados. Após 15 semanas de diabete, o ERG e os PVE diminuíram significativamente e todos os animais desenvolverarn cataratas maduras. O número de células Brn3a(+) e as projecóes ao CS diminuíram significativamente, mas náo foram observadas diferencas no numero de células melanopsina (+), nos níveis de melanopsina e nas projegóes retinais aos NSQ e ao NPO. O reflexo pupilar aferenre foi conservado depais de dez semanas de diabete. As 15 semanas de diabete diminuiu a expressáo de c-Fos nos NSQ induzida por luz. Nos animais diabéticos conservou-se o ritmo diario de atividade locomotora, embora tenha sido observado aumento no tempo necessário para a ressincronizacáo depois de um retardo de fase de (guarro horas). A lensectomia reverteu significativamente a reducáo na expressáo de c-Fos e na ressincro nizacáo do ritmo de atividade locomotora induzida por diabetes.
Conclusóes Esses resultados sugerem que o substrato neuronal do sistema visual náo formador de imagens é preservado em etapas avancadas de diabete e que a lensectomia poderia restaurar as alteracóes circadianas induzidas por diabete experimental.
Subsidios. ANPCyT, UBA, CONICET.
Efecto de la isquemia retinal sobre el sistema visual no formador de imágenes
González Fleitas F, Dorfman D, Rosenstein RE
Laboratorio de Neuroquinika Retiniana. y Oftalmología Experimental, Departamento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina, UBA, CEFyBO-CONICET
florgf 880hormail.com
Objetivos. Las células ganglionares retinales intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs) que expresan el fotopigmento melanopsina están involucradas en respuestas visuales no formadoras de imágenes, como la sincronización de los ritmos circadianos y el reflejo pupilar. En este trabajo examinamos el sistema visual no formador de imágenes en un modelo de isquemia retinal aguda y deletérea.
Métodos. En ratas Wistar macho adultas se indujo isquemia retinal por aumento de la presión intraocular a 120 mmHg durante 40 minutos. A los 14 días pos-isquemia se analizó el número total de células ganglionares y de células que expresan melanopsina (por inmunohistoquímica), los niveles de melanopsina (por western blot), el reflejo pupilar aferente (con estimulo de 1200 lux por 30 segundos) y el transporte anterógrado desde la retina al colículo superior y los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) (por transporte de la subunidad beta de la toxina del cólera).
Resultados. La isquemia indujo una caída muy significativa en la amplitud de las ondas a y b del electrorretinograma y del número de células ganglionares totales. Sin embargo, no se observaron diferencias en cuanto al número de células que expresan melanopsina ni a los niveles de este fotopigmento. Las proyecciones retinales al colículo superior disminuyeron marcadamente en ojos isquémicos, pero se preservaron en forma notable las proyecciones retinales a los NSQ. El reflejo pupilar aferente no se modificó significativarnente en ojos isquémicos.
Conclusiones. Estos resultados sugieren una particular resistencia del sistema visual no formador de imágenes en general y de las células ganglionares intrínsecamente fotosensibles y sus axones en particular, frente a un daño retinal de magnitud como el inducido por una isquemia aguda.
Subsidios. ANPCyT, UBA, CONICET.
Effect of retinal ischemia on the non-image-forming visual system
Objectives. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs) expressing the photopigment melanopsin are involved in non-image-foilrung visual responses, such as entrainment of circadian rhythms and pupillary light reflex. This paper examines the non-image-forming visual system in a model of acule and deleterious retinal ischemia.
Methods. Retinal ischemia was induced ín adult mate Wistar rats by increasing intraocular pressure to 120 mmHg for 40 minutes. Fourteen days after ischemia we analyzed: the total number of ganglion cells and melanopsin-expressing cells (by immunohistochemistry), melanopsin levels (by western holt), afferent pupillary reflex (with a stimulus of 1200 lux per 30 seconds) and anterograde transport from the retina to the superior colliculus and suprachiasmatic nuclei (SCN) (by cholera toxin beta subunit transport).
Results. Ischemia induced a very significant drop in the electroretinogram a- and b-wave amplitudes and in the counts of total ganglion cells. However, there were no differences in the number of melanopsinexpressing cells, neither there was in the levels of this photopigment. Retinal projections to the superior colliculus decreased markedly in ischemic eyes, but retinal projections ro the SCN were strikingly preserved. There was no significant change in the afferent pupillary reflex of ischemic eyes.
Conclusions. These results suggest that when there is extensive retinal damage such as the one induced by acure ischemia, there is a peculiar resistance of the non-image-forming visual system in general, and particularly of the intrinsically photosensitive ganglion cells and their axons.
Supports. ANPCyT, UBA, CONICET.
Efeito da isquemia retiniana sobre o sistema visual nao formador de imagenes
Objetivos. As células ganglionares retinais intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs) que expressam o fotopigmento melanopsina estío envolvidas em respostas visuais náo formadoras de imagens, como a sincronizaçao dos ritmos circadianos e o reflexo pupilar. Neste trabalho examinamos o sistema visual náo formador de imagens num modelo de isquemia retiniana aguda e deletérea.
Métodos. Em ratos Wistar macho adultos foi induzi-da isquemia retiniana por aumento da pressáo intraocular a 120 mmHg durante 40 minutos. Aos 14 días pós-isquemia foi analisado o número total de células ganglionares e de células que expressam melanopsina (por imuno-histoquímica), os níveis de melanopsina (por western blot), o reflexo pupilar aferente (com estímulo de 1200 lux por 30 segundos) e o transporte anterógrado a partir da retina para o colículo superior e os núcleos supraquiasmáticos (NSQ) (por transporte da subunidade beta da toxina da cólera).
Resultados. A isquemia induziu urna queda muito significativa na amplitude das ondas a e b do eletro-rretinograma e o número de células ganglionares totais. Contudo, náo se observaram diferengs no número de células que expressam melanopsina nem nos níveis deste fotopigmento. As projeçoes retinianas ao colículo superior diminuíram marcadamente nos olhas isquémicos, mas se preservaran em forma notável as projegóes retinianas aos NSQ. O reflexo pupilar aferente náo foi modificado significativamente nos olhos isquémicos.
Conclusóes. Estes resultados sugerem urna particular resistencia do sistema visual náo formador de imagens cm geral e das células ganglionares intrinsecamente fotossensiveis e seus axónios em particular, frente a um dano da retina de magnitude corno o induzido por urna isquemia aguda.
Subsidios. ANPCyT, UBA, CONICET.
Las neuronas de retina son capaces de sintetizar ácido docosahexaenoico a partir de ácido eicosapentaenoico para promover la diferenciación y supervivencia de los fotorreceptores
Agnolazza DLa, Politi LEa, Agbaga M-Pb, Anderson REb, Rotstein NPa
aInstituto de Investigaciones Bioquímicos, Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca.
bUniversity of Oklahoma, Health Science Center, Estados Unidos.
Objetivos. La muerte de los fotorreceptores (FR) es un rasgo común a muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina. Demostramos que el ácido docosahexaenoico (DHA), el ácido graso poliinsaturado más abundante en la retina, protege a los FR del daño oxidativo y promueve su diferenciación y que otro ácido poliinsaturado, el ácido eicosapentaenoico (EPA) presenta un efecto antiapoptótico y promotor de la diferenciación en los FR similar al DHA. El EPA es precursor metabólico del DHA en distintos tipos celulares. Esta síntesis ocurre en la retina, pero se desconoce aún si las neuronas pueden realizarla. Investigamos ahora si las neuronas de retina in vitro pueden sintetizar DHA a partir de EPA y si el EPA ejerce sus efectos por sí mismo o a través de su conversión a DHA.
Métodos. Cultivos neuronales de retina de rata se suplementaron o no con EPA y con otros ácidos grasos (palmítico, oleico, araquidónico) y se trataron a día 3 con los oxidan tes paraquat (PQ) o H202. Para inhibir la síntesis de DHA, los cultivos se trataron con o sin CP24879, inhibidor de las 45/A6 desaturasas que participan en dicha síntesis, y luego con H202. La muerte celular se evaluó con loduro de propidio, la apoptosis por DAPI y TÚNEL y la integridad mitocondrial con Mitotracker. La diferenciación de los FR se analizó cuantificando expresión de opsina y la composición de ácidos grasos por GLC.
Resultados. El agregado de EPA a los cultivos protegió a los FR de la apoptosis inducida por daño oxidativo y aumentó los niveles de DHA pero no los de EPA en los lípidos neuronales. Otros ácidos grasos no mostraron efecto protector en los FR. El agregado de CP24879, previo al de EPA, disminuyó los niveles de DHA en las neuronas, aumentando el de su precursor inmediato. Este inhibidor bloqueó el efecto protector e inductor de diferenciación del EPA.
Conclusiones. Estos resultados sugieren que el DHA, y no el EPA, sería responsable del efecto protector y promotor de diferenciación de los FR y evidencian por primera vez que neuronas aisladas de retina son capaces de elongar y desaturar al EPA para sintetizar el DHA.
Subsidios. ANPCYT, UNS y CONICET.
Retinal neurons syntbesize docosabeicaenaic acidfrinn eicosapentaenoic aeid lo promote differentiation and survival in photoreceptors
Objectives. Photoreceptor (PR) death is a common feature to many neurodegenerative retinal diseases. We have demonstrated that docosahexaenoic acid (DHA), the most abundant polyunsaturated fatty acid of the retina, protects PRs from oxidative damage and promo tes their differentiation, and that another polyunsaturated acid, eicosapentaenoic acid (EPA) elicits antiapoptotic and differentiation-promoting effects in PRs, similar to that of DHA. EPA is the metabolic precursor of DHA in dífferent cell types. This synthesis takes place in the retina, but whether neurons can generare it still remains unknown. The purpose of this study is to investigare if retinal neurons can synthesize DHA from EPA in vitro and íf EPA exerts its effects by itself or via its conversion inca DHA.
Methods. Rat retinal neuronal cultures were supplemented or not with EPA and other fatty acids (palmitic, oleic, arachidonic) and were treated on day 3 with paraquat oxidants (PQ) or H202. In arder to inhibir DHA synthesis, cultures were treated with or without CP24879, 145/A6 desaturase inhibitor involved in chis synthesis, and then with H202. Cell death was evaluated with propidum iodide, apoptosis, with DAPI and TUNEL, and Initochondrial integrity, by Mitotracker. PR differentiation was analyzed by quantification of opsin expression and the composition of fattyacids, by GLC.
Results. Addition of EPA to cultures prorected PRs from oxidative damage-induced apoptosis and increased DHA levels, rhough not EPA levels, in neuronal lipids. Orher fatty acids failed to evidence any PR-protective effect. Addition of CP24879, previous to EPA addition, reduced DHA levels in neurons, thereby increasing the levels of its immediare precursor. This inhíbitor blocked the protective and differentiation-inducing effects of EPA.
Conclusions. These results suggest that DHA, but not EPA, may be responsible for the PR-protective and differentiation-promoting effects and they are the first evidence of neurons isolated from the retina that are able ro elongate and desaturate EPA to synthesize DHA.
Supports. ANPCYT, UNS and CONICET.
Os neurónios da retina podem sintetizar ácido docosahexaenoico a partir de ácido eicosapentaenoico para promover a dIferencialáo e sobrevivéncia de fotorreceptores
Objetivos. A marre dos fotorreceptores (FR) é um rasgo comum a muitas doengas neurodegenerativas da retina. Demostramos que o ácido dosahexaenóico (DHA), o ácido grasso poliinsaturado mais abundante na retina, protege aos FR do dano oxidative e promove sua diferendagáo e que ourro ácido poliinsaturado, o ácido eicosapentaenóico (EPA) apresenta um efeito antiapoptótico e promotor da diferenciagáo nos FR semelhante ao DHA. O EPA é precursor metabólico do DHA em distintos tipos celulares. Essa síntese ocorre na retina, mas se desconhece ainda se os neurónios podem realizá-la. Pesquisamos agora se os neurónios de retina in vitro podem sintetizar DHA a partir de EPA e se o EPA exerce seus efeiros por ele mesmo o através da sua conversáo a DHA.
Métodos. Culturas de neuroníos de retina de rato suplementaram-se ou náo com EPA e com outros ácidos graxos (palmítico, oleico, araquidánico) e foram tratados no dia trés com os oxidantes paraquat (PQ) ou H202. Para inibir a síntese de DHA, as culturas foram tratadas com ou sem CP24879, inibidor das Δ5/Δ6 desaturase que parricipam nessa síntese, e depois com H202. A marre celular foi avaliada com loduro de propidio, a apoptose por DAPI e TUNEL e a integridade mitocondrial com Mitorracker. A diferenciagáo dos FR foi analisada quantificando expressáo de opsina e a composigáo de ácidos graxos por GLC.
Resultados. A adigáo de EPA ás culturas protegen os FR da apoptose induzida por dano oxidarivo e aumentou os níveis de DHA, mas náo os de EPA nos lipidios neuronais. Outros ácidos graxos náo mostraram efeito pro tetar nos FR. O agregado de CP24879, previo ao de EPA, dimínuiu os níveis de DHA nos neurónios, aumentando o de seu precursor imediato. Este inibidor bloqueou o efeito protetor e indutor de diferenciagáo do EPA.
Conclusóes. Esses resultados sugerem que o DHA, e náo o EPA seria responsável pelo efeito protetor e promotor de diferenciado dos FR e evidenciara pela primeira vez que neurónios isolados de retina tétn capacidade para elongar e desaturar o EPA para sintetizar o DHA
Subsidios. ANPCYT, UNS e CONICET.
La exposición a la luz de las retinas bovinas modula positivamente la activación de la proteína quinasa C alfa (PKCa) y de la diacilglicerol quinasa (DAGK) en la fracción nuclear de fotorreceptores
Natalini PM, Mateos MV, Giusto NM, Ilincheta de Boschero MG
Instituto de Investigaciones Bioquírnicas de Bahía Blanca (INIBIBB-CONICET), Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca.
pntalini@criba.edu.ar
Objetivos. El objetivo general del trabajo fue analizar el efecto de la exposición de retinas a la luz en la actividad de la diaciliglicerol quinasa (DAGK) y de la proteína quinasa C (PKC) en una fracción rica en núcleos de células fotorreceptoras. Los objetivos particulares fueron: a) determinar si la luz, a través de la activación de una fosfolipasa tipo C (PIP2-PLC), genera una respuesta nuclear en la actividad DAGK; b) determinar si la luz modifica el contenido y activación de PKCct; c) evaluar la correlación del efecto lumínico sobre la actividad DAGK a dos temperaturas diferentes.
Materiales y métodos. Las retinas se obtuvieron de ojos bovinos adaptados durante 2 horas 30 minutos a oscuridad (0°C) y las copas fueron expuestas durante 15 minutos en oscuridad al inhibidor PIP2-PLC, U73122 (10 pm) o al vehículo (DMSO 0,01%) y luego expuestas durante 30 minutos a luz u oscuridad en dichas condiciones. Este procedimiento se realizó a 0° o a 22°. Las retinas fueron homogenizadas en sacarosa 0.25 M y combinadas con sacarosa 2.2 M para obtener un homogenado 1.6 M, sembrado sobre un gradiente de sacarosas 2.4 M-2.2 M y centrifugado 70 minutos a 25000 rpm. Se obtuvo un pellet altamente purificado en núcleos de células fotorreceptoras (FNF). La pureza del FNF se corroboró por microcopía electrónica y western blot (WB). La actividad DAGK en los núcleos de FNF se detectó midiendo la formación de PA durante 10 minutos de incubación empleando ATPy32P. El contenido de PKCct total y activada (fosfo PKCa) se detectó mediante WB.
Resultados. Los resultados mostraron que la luz estimula la formación de PA nuclear (67%) y que ese efecto fue revertido por la preincubación con el L173122. Cuando el procedimiento se realizó a 22°C los niveles de actividad detectada en el núcleo fueron superiores a los observados a 0° pero el efecto de la luz y la reversión por U73122 fueron proporcionalmente similares. La luz provoca un aumento en el contenido nuclear de PKCct activada respecto de la condición de oscuridad, con niveles similares de PKCa total.
Conclusión. Los resultados indicarían que la exposición a la luz en retina in situ genera una activación de la PKCct en los núcleos de fotorreceptores que se debe posiblemente al incremento del DAG producto de la activación de PIP2-PLC, mientras que la transformación del DAG a PA por DAGK operaría como regulador negativo.
Subsidios. PIP (CONICET) y PGI (SGCyT, UNS). Agradecimiento. A los Dres. Nora Rotstein y Luis Politi por la provisión de anticuerpos.
Bovine retina exposure to light positively modulates the activation of protein kinase C alpha (PKCa) and diacylglycerol kinase (DAGK) in the photoreceptor nuclei fraction
Objectives: The general goal of this study was to analyze the effect of retinal exposure to light in the activity of diacylglycerol kinase (DAGK) and protein kinase C (PKC) in a photoreceptor cell nucleirich fraction. The specific goals were to: a) determine whether light, through the activation of a phospholipase C (PIP2- PLC) generates nuclear response in DAGK activity; b) to determine if light modifies PKCct contents and activation; c) to evaluate the correlation of the luminic effect on DAGK activity at two dífferent temperatures.
Materials and methods. Retinas were obtained from dark-adapted bovine eyes after exposure of 2 hours 30 minutes to darkness (0°C); the cups were exposed during 15 minutes in the dark to PIP2-PLC, U73122 (10 pm) or vehicle (DMSO 0.01%) and subsequently to light or darkness for 30 minutes under the same conditions. This procedure was carried out at 0° or 22°. Retinas were homogenized in 0.25 M sucrose and combined with 2.2 M sucrose solution to obtain a 1.6 M homogenate layered on top of a sucrose gradient of 2.4 M — 2.2 M and centrifuged for 70 min at 25000 rpm. A highly purified pellet in photoreceptor cell nuclei (PCN) was thus obtained. Purity of the PCN was verified by electron microscopy and western blot (WB). DAGK activity at PCN nuclei was detected by measuring PA formation during 10-min incubation using ATI).-.32P. The content of total and activated PKCct (phospho-PKCci) was detected by WB.
Results. The results evidenced that light stímulates nuclear PA formation (67%) and that this effect was reversed by preincubation with U73122. When the procedure was performed at 22°the activity levels detected in the nucleus were higher than those observed at 0°, but the effect of light and U73122-induced reversion were proportionately similar. Light produces an increase in the nuclear content of activated PKCa with respect to dark conditions, with similar levels of to talPICCa.
Conclusion. The results suggest that in situ retina' exposure to light may generare PKCa activation in the photoreceptor nuclei that might be due to the DAG increase as a consequence of PIP2-PLC activation, while DAG-to-PA conversion by DAGK could operare as a negative regulator.
Supports. PIP (CONICET) and PGI (SGCyT, UNS). Acknowledgment. Nora Rotstein, M.D. and Luis Politi for the provision of antibodies.
A exposifáo á luz das retinas bovinas modula positivamente a ativafáo da proteína quina-se C alfa (PKCa) e da diacilglicerol quinase (DAGK) na fraçáo nuclear de fotorreceptores
Objetivos. O objetivo geral do trabalho foi analisar o efeito da exposiçao de retinas á luz na atividade da diaciliglicerol quinase (DAGK) e da proteína quina-se C (PKC) numa frasáo rica em núcleos de células fotorreceptoras. Os objetivos particulares foram: a) determinar se a luz, através da ativasáo duma fosfolipasa tipo C (PIP2-PLC), gera urna resposta nuclear na atividade DAGK; b) determinar se a luz modifica o conteúdo e ativai;áo de PKCa; c) avahar a correlacáo do efeito luminoso sobre a atividade DAGK em duas temperaturas diferentes.
Materiales y métodos. As retinas foram obtidas de olhos bovinos adaptados durante 2 horas 30 minutos a escuridáo (0°C) e as copas foram expostas durante 15 minutos em escuridáo ao inibidor PIP2-PLC, U73122 (10 pm) ou ao veículo (DMSO 0,01%) e logo expostas durante 30 minutos á luz ou escuridáo nessas condicóes. Esse procedimento foi realizado a 0° ou a 22°. As retinas foram homogeneizadas em sacarosa 0.25 M e combinadas com sacarosa 2.2 M para obter um homogenado 1.6 M, semeado sobre um gradiente de sacarosas 2.4 M-2.2 M e centrifugado 70 minutos a 25000 rpm. Obteve-se um pellet altamente purificado em núcleos de células fotorreceptoras (FNF). A pureza do FNF foi corroborada por microcopia electrónica e western blot (WB). A atividade DAGK nos núcleos de FNF foi detectada medindo a formarlo de PA durante 10 minutos de incubarlo empregando ATPy32P. O conteúdo de PKCet total e ativada (fosfo PKCcit) foi detectado por WB.
Resultados. Os resultados mostraram que a luz estimula a forrna0o de PA nuclear (67%) e que esse efeito foi revertido pela pré-incubnáo com o U73122. Quando o procedimento foi realizado a 22°C os níveis de atividade detectada no núcleo foram superiores aos observados a 0°, mas o efeito da luz e a reversáo por U73122 foram proporcionalmente semelhantes. A luz provoca aumento no con teúdo nuclear de PKCot ativada a respeito da condicao de escuridáo, com ni veis semelhantes de PKCa total.
Conclusáo. Os resultados indicariam que a exposicáo á luz em retina in situ gera urna ativasáo da PKCa nos núcleos de fotorreceptores causada, possivelmente, pelo incremento do DAG produto da ativacáo de PIP2-PLC, enquanto a transforma, áo do DAG para PA por DAGK operaria como regulador negativo.
Subsidios. PIP (CONICET) e PGI (SGCyT, UNS).
El ácido retinoico induce apoptosis y diferenciación en neuronas fotorreceptoras de retina activando la vía de la p38/MAPK
Politi LE, De Genaro P, Simon MV, Rotstein NP
Instituto de Investigaciones Bioquímicos de Bahía Blanca (INI¬BIBB-CONICET), Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca.
inpolirilperiba.edu.ar
Objetivo. El ácido retinoico (AR) juega un rol crucial en la diferenciación de distintos tejidos y es crítico durante el desarrollo del sistema nervioso, incluyendo la retina. Además, se ha mostrado que induce apoptosis en distintos tipos celulares. No se conocen con certeza los mecanismos por los cuales el AR induce estos efectos antagónicos. En este trabajo analizaremos los efectos del AR y los mecanismos que activa en neuronas de retina.
Métodos. Cultivos neuronales de retina de rata se trataron con AR al día O y al día 2 y se analizó el efecto del pretratamiento con o sin ácido docosahexaenoico (ADH), un factor de supervivencia para fotorreceptores (FR) y Z-VAD-FMK, un pan inhibidor de casposas. A distintos tiempos se evaluaron parámetros de diferenciación y apoptosis. Para establecer si el AR activa la vía de p38/MAPK, se analizaron los nive les P-p38 en cultivos con y sin AR, y los efectos del agregado de SB203580, inhibidor específico de p38, mediante inmunocitoquímica y western blot.
Resultados. El agregado de AR a día O, cuando los progenitores de FR permanecen en el ciclo celular, incrementó la apoptosis de los FR; esto no ocurrió cuando fue agregado al día 2, cuando los progenitores ya han salido del ciclo. El tratamiento con Z-VAD-FMK impidió la apoptosis inducida por AR. El AR incrementó selectivamente la expresión de opsina y periferina en los FR, independientemente del momento de su agregado, y estimuló el crecimiento axonal en FR y células amacrinas. El AR estimuló la rá-pida fosforilación de p38, mientras que el SB203580 bloqueó los efectos del AR en la expresión de opsina y apoptosis sin alterar el crecimiento axonal. Notablemente, la suplemen.tación de los cultivos con ADH previno la apoptosis inducida por el AR.
Conclusiones. El AR promovió la diferenciación de los FR a distintos tiempos in vitro e indujo simultáneamente su apoptosis temprana sólo mientras existieron progenitores en proliferación. El AR activó la vía de p38/MAPK para estimular diferenciación y apoptosis de los FR, pero no para promover el crecimiento axonal, lo que sugiere que activaría distintas vías de señalización simultáneamente. La prevención de dicha apoptosis por el ADH sugiere la necesidad de una estricta coordinación de los factores de diferenciación, como el AR y supervivencia, como el ADH, para preservar el número adecuado de FR durante el desarrollo de la retina.
Subsidios. FONCYT, CONICET y UNS.
Retinoic acid induces apoptosis and differentiation of retinal photoreceptor neurosis through p3811VIAPK activation
Objective. Retinoic acid (RA) has a vital role in the differentiation of the different tissues and is critical during the nervous system development, including the retina. Furthermore, it has been demonstrated to induce apoptosis ín different cell types. The mechanisms by which RA induces these antagonic effeets is unclear. This study analyzes the effects of RA and the mechanisms activated by it in retinal neurons.
Methods. Rat retinal neuronal cultures were treated with RA on days O and 2 with subsequent analysis of the effect of pretreatment with or without docosahexaenoic acid (DHA), a survival factor for photoreceptors (PR) and Z-VAD-FMK, a pancaspase inhibitor. Differentiation and apoptosis parameters were evaluated at different time-points. To establish whether RA activares the p38/MAPK pathway, P-p38 levels were analyzed in cultures with and without RA, and the effects of addition ofSB203580, a p38-specific inhibitor, were assessed by immunocytochemistry and western blot.
Results. RA addition on day O, when PR progenitors remain in the cellular cycle, increased PR apop-tosis; this did not occur with RA addition on day 2, when progenitors had already come out of the cycle. Treatment with Z-VAD-FMK prevented RA-induced apoptosis. RA selectively increased opsin and peripherin expression in the PRs, regardless of the time-paínt ar which ir was added, and stimulared axonal growth in PRs and amacrine cells. RA stimulated rapid p38 phosphorylation, while SB203580 blocked the effects of RA in opsin expression and apoptosis with no changes ín axonal growth. Strikingly, DHA supplementation of cultures prevented AR-induced apoptosis.
Conclusions. RA promoted PR differentiation at different time-points in vitro and sitnultaneously induced their early apoptosis only while there were proliferating progenitors. RA activated the p38/ MAPK pathway to stimulate PR differentiation and apoptosis, but not to promote axonal growth, thus suggesting that it might simultaneously activare signaling pathways. Prevention of the abovementioned DHA-induced apoptosis suggests the need for strict coordination of differentiation factors, such as RA; and survival, such as DHA, to preserve the adequate nurnber of PRs during retinal development.
Supports. FONCYT, CONICET and UNS.
O ácido retinoico induz apoptose e diferenciará o ein neurónios fotorreceptores de retina ativando a vía da p38/MAPK
Objetivo. O ácido retinoico (AR) tem um papel fundamental na diferenciado de diversos tecidos e é fundamental durante o desenvolvimento do sistema nervoso, incluindo a retina. Além disso, foi mostrado que induz apoptose em diferentes tipos celulares.
Os mecanismos pelos quais o AR induz esses efeitos antagónicos nao ssio conhecidos com certeza.
Neste trabalho analisaremos os efeitos do AR e os mecanismos que ativa nos neurónios da retina.
Métodos. Culturas neuronais de retina de rato foram tratadas com AR no dia O e no dia 2 e foi analisado o efeito do pré-tratamento com ou sem ácido docosahexaenoico (ADH), una fator de sobrevívéncia para fotorreceptores (FR) e Z-VAD-FMK, um pan inibidor de caspases. Em diferentes momentos foram avaliados parámetros de diferenciasáo e apoptose. Para estabelecer se o AR ativa a via de p38/MAPK, foram analisados os níveis P-p38 em culturas com e sem AR, e os efeitos do acréscimo de SB203580, inibidor específico de p38, mediante imunocitoquímica e western blot.
Resultados. O acréscimo de AR no dia zero, guando os progenitores de FR permanecem no ciclo celular, incrementou a apoptose dos FR; isso náo ocorreu guando adicionado no dia 2, guando os progenitores já saíram do ciclo. O tratamento com Z-VAD-FMK impediu a apoptose induzida por AR. O AR aumentou seletivamente a expressáo de opsina e periferina nos FR, independentemente do momento da sua adicáo, e estimulou o crescimento axonal em FR e células amácrinas. O AR estimulou a rápida fosforilnáo de p38, enquanto o SB203580 bloqueou os efeitos do AR na expressáo de opsina e apoptose sem alterar o crescimento axonal.
Notavelmente, a suplementacáo das culturas com ADH preveniu a apoptose induzida pelo AR.
Conclusóes. O AR promoveu a diferenciacáo dos FR em diferentes tempos in vitro e induziu simultaneamente a apoptose precoce só enquanto existiram progenitores em proliferado. O AR ativou a via de p38/MAPK para estimular diferenciaylo e apoptose dos FR, mas náo para promover o crescimento axonal, o que sugere que ativaria diferentes vías de sinalizasáo simultaneamente. A prevencáo dessa apoptose pelo ADH sugere a necessidade de uma escrita coordenasáo dos fatores de diferenciacáo, como o AR e sobrevivéncia, corno o ADH, para preservar o número adequado de FR durante o desenvolvimento da retina.
Subsidios. FONCYT, CONICET e UNS.
Localización de dos isoformas del receptor de glucocorticoides en la retina del ratón
Marquioni Ramella MD, Cubilla MA, Suburo AM
Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral, Pilar (Buenos Aires)
mmarquio@cas.austral.edu.ar
Objetivos. Los glucocorticoides (GC) protegen a los fotorreceptores del daño provocado por iluminación excesiva mediante el receptor de glucocorticoides (GR). Se conocen dos isoformas principales de este receptor: GRot, el receptor nuclear clásico, y GRI3, carente de ligandos conocidos, que actúa como inhibidor. Para investigar el rol de estos receptores en la protección de la retina determinamos su localización en retinas expuestas a distintas condiciones de iluminación.
Métodos. Empleamos ratones Balb-c de 5-7 semanas de edad, criados bajo iluminación cíclica (12 h 60 lux: 12 h oscuridad). Las retinas fueron estudiadas a mediodía y a medianoche o después de exposición a oscuridad prolongada (OP) durante 7 días, o a 1500 lux durante 6 horas. Se utilizaron anticuerpos específicos para cada isoforma (Dr. J. A Cidlowski), detectados en forma inmunoenzimática.
Resultados. Bajo condiciones fisiológicas encontramos inmunorreactividad GRα (GRα-IR) en los núcleos celulares del epitelio pigmentario (EP), la nuclear externa y la nuclear interna (CNE y CNI). Los núcleos de las células de Müller mostraban más IR que otros núcleos de la misma capa. Se observó GRα-IR en la limitante externa (mle), los segmentos internos y terminales de la plexiforme externa (CPE). En estas localizaciones la IR fue más intensa al mediodía.
GRα-IR fue casi indetectable después de OP. Después de 1500 lux fue semejante a la del mediodía.
Detectamos GRβ-IRen todas las capas nucleares de la retina neural. La GRβ-IR de la mle y la CPE prácticamente desapareció después de OP. Después de 1500 lux, la GRβ-IR fue semejante a la observada en horas del mediodía. El citoplasma del EP presentó intensa GRβ-IR.
Conclusiones. La retina expresó ambas isoformas del GR. En la retina externa se encontró GRα tanto en localizaciones nucleares como no nucleares. La presencia de GRα-IR en la mle y en la CPE sugiere su asociación con acciones no genómicas. Curiosamente, estas dos localizaciones también mostraron abundante GRO-β. Los núcleos de la CNI que presentaron intensa GRα-IR sugirieron una gran actividad genómica a nivel de las células de Müller, que no estaría bloqueada por la presencia de GRβ. Por el contrario, la intensa GRO-IR del EP implicaría una fuerte función reguladora. El descenso de GRα-IR durante la oscuridad prolongada sugirió que los glucocorticoides endógenos sólo serían necesarios para la supervivencia de los fotorreceptores expuestos a la luz, aün en niveles fisiológicos.
Subsidio. PICTO-AUSTRAL 2008-00090
Localization of two gltscocorticoiel receptor isoforms in the marine retina
Objectives. Glucocortícoids (GC) protect photoreceptors from damage caused by excess light via the glucocorticoid receptor (GR). There are two known main isoforms of this receptor: GRα, the classical nuclear receptor, and GRβ, which has no known ligands, and acts as an inhibitor. To investigare the role of these receptors in retinal protection we have determinad their location in retinas exposed to different lighting conditions.
Methods. 5-7-week-Balb-c mice, reared under cyclic lighting (12 h 60 lux : 12 h darkness) were used. Retinas were studied at noon and midnight or after prolonged dark exposure (PD) for 7 days or to 1500 lux for 6 hours. Specific antibodies for each isoform (LA. Sidlowski, M.D.), detected by immunoenzymatic assay, were used.
Results. Under physiologic conditions we found GRa immunoreactivity (GRa-IR) in the cell nuclei of the pigment epithelium (PE), outer nuclear layer (ONL) and inner nuclear layer (INL). Müller cell nuclei evidenced more IR than other
nuclei of the same layer. There was GRα-IR in the external limiting membrane (elm), inner segrrients and terminals in the outer plexiform layer (OPL). In these locations, IR was more intense at noon. GRα-IR was almost undetectable after PD, whereas after 1500 lux it was similar to that of noon. We detected GRa-IR ín all the nuclear layers of the neural retina. GRα-IR of the elm and OPL had almost dísappeared after PD. After 1500 lux, GRβ-IR was similar to that observed at noon. The PE cytoplasm had intense GRα-IR.
Conclusions. The retina expressed both GR isoforms. In the outer retina GRα was found both in nuclear localizations and in non-nuclear ones. The presence of GRα-IR in the elm and in the OPL suggests an association with non-genomic actions. Strikingly, both localizations also evidenced abundant GRβ-IR. Intense GRα-IR evidenced in INL nuclei suggested high genomic activity at the level of Müller cells, apparently not blocked by the presence of GRβ. Conversely, the intense GRβ-IR of the PE might entail a strong regulatory function. GRα-IR decrease in prolonged darkness suggested that endogenous glucocorticoids would only be necessary for the survival of light-exposed photoreceptors, even at physiologic levels.
Supports. PICTO-AUSTRAL 2008-00090.
Localizalito de duas isoformas do receptor de glicocorticoides na retina do rato
Objetivos. Os glicocorticoides (GC) protegem os fotorreceptores do dano provocado pela iluminagáo excessiva mediante o receptor de glicocorticoides (GR). Duas isoformas principais sáo conhecidos neste receptor: GRα, o receptor nuclear clássico e GRβ, carente de ligantes conhecidos, que age como inibidor. Para pesquisar o papel destes receptores na proreçáo da retina determinamos sua localizaçáo nas retinas exportas em diferentes condiçoes de iluminarçao.
Métodos. Utilizamos ratos Balb-c de 5-7 semanas de idade, criados sob iluminacáo cíclica (12 h 60 lux: 12 h escuridáo). As retinas foram estudadas no meiodia e na meianoite ou depois de urna exposicáo á escuridáo prolongada durante sete dias, ou a 1500 lux durante seis horas. Foram utilizados anticorpos específicos para cada isoforma (Dr. J. A Cidlowski), detectados de forma imunoenzimática.
Resultados. Sob condiçoes fisiológicas encontramos imunorreatividade GRα (GRα-IR) nos núcleos celulares do epitelio pigmentário (EP), a nuclear externa e a nuclear interna (CNE e CNI). Os núcleos das células de Müller mostravam mais IR do que os outros núcleos da mesma carnada. Observou-se GRα-IR na limitante externa (mle), nos segmentos internos e terminais da plexiforme externa (CPE). Nessas localizaçoes a IR foi mais intensa durante o meio-dia.
GRα IR foi quase indetectável depois de depois de OP. Depois de 1500 lux foi semelhante a do meio-dia
Detectamos GRIS-IRen todas as camadas nucleares da retina neural. A GRβ-IR da mle e a CPE praticamente desapareceu depois da prologada exposicáo á escuridáo. Depois de 1500 lux, a foi semelhante á observada nas horas do meio-dia. O citoplasma do EP apresentou intensa GRβ-IR.
Conclusóes. A retina expressou ambas as isoformas do GR. Na retina externa foi encontrado GRα tanto em localizagóes nucleares quanto náo nucleares. A presenta de GRα-IR na mle e na CPE sugere sua associacáo com açoes náo genómicas. Curiosamente, essas duas localizaçoes mostraram também abundante GRβ-IR. Os núcleos da CNI que apresentaram intensa GRα-IR sugeriram urna grande atividade gennomica no nivel das células de Müller, que náo estaría bloqueada pela presença de GRβ. Pelo contrário, a intensa GRβ-IR do EP implicaria urna forte furwáo reguladora. O descenso de GRα-IR durante a escuridáo prolongada sugeriu que os glicocorticoides enció genos apenas seriara necessarios para a sobrevivéncia dos fotorreceptores expostos á luz, ainda em níveis fisiológicos.
Subsidio. PICTO-AUSTRAL 2008-00090.
Expresión de alfa-1-antitripsina (A1AT) en la retina de ratas diabéticas y no diabéticas
Ortiz. GA, Mancini JE, Gallo JE
Nanomedicine & Vision Group, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral.
Servicio de Oftalmología, Hospital Universitario Austral, Pilar (Buenos Aires),
g_a_ortiz@yahoo.com.ar
Introducción. La retinopatía diabética (RD) es la causa más frecuente de ceguera en la población en edad laboral. Los procesos inflamatorios son de relevancia debido a la posibilidad de causar ceguera. Las herramientas clásicas que dispone el oftalmólogo para limitar la reacción inflamatoria están circunscriptas a dos tipos de drogas: los antiinflamatorios no esteroides (AINES) y los corticoides. Ambas drogas son efectivas y bastante bien toleradas en procesos inflamatorios agudos. Sin embargo, el problema aparece cuando se requiere de la administración prolongada, surgiendo entonces efectos indeseables relevantes tanto locales como sistémicos. En este trabajo se desea evaluar la utilización de la alfa-l-antitripsina (A1AT) como an tin flama torio endóge no.
Propósito. Identificar la presencia de la alfa- 1-antitripsina (A1AT), un inhibidor de serino proteasas (ser-pila), en la retina de las ratas diabéticas y no diabéticas.
Métodos. Al segundo día de la vida las ratas Wistar neonatales recibieron una inyección intraperi roncal de estreptozotocina (STZ). Se clasificaron como ratas diabéticas aquellas que luego de 2 días desde la inducción con STZ tenían una glucemia mayor a 200mg/d1. Grupos de cuatro ratas diabéticas y cuatro ratas control fueron sacrificadas y analizadas a las 16 semanas. Se realizaron extractos proteicos a partir de las retinas (control vs. diabéticos) y en ellos se analizó la expresión de A1AT con la técnica de western blot (WB). Para este ensayo se utilizó un anticuerpo primario anti-1IAT y como control anticuerpos anti¬GAPDH. Además, cortes transversales de las retinas remanentes se montaron en portaobjetos y analizados mediante inmunofluorescencia, utilizando el mismo anticuerpo anti-AlAT.
Resultado. En los ensayos de WB se identificó la expresión de la proteína A1AT en extractos proteicos de retina en los animales diabéticos y no diabéticos. No se observaron diferencias significativas en la expresión de la enzima entre los dos grupos de animales.
Conclusión. Nuestra investigación muestra por primera vez la presencia de la A1AT en la retina de animales diabéticos y no diabéticos. Estos resultados junto con la incorporación reciente de la A1AT en el tratamiento de la diabetes tipo 1 sugieren estudiar el rol de dicha proteína en procesos inflamatorios de la retina como es el caso de la retinopatía diabética,
Expression of alpha-1-antitrypsin (A1AT) in the retina of diabetic and non-diabetic rats
Introduction. Diabetic retinopathy (DR) is the most common cause of blindness in the working-age population. Inflammatory processes are important due to their potential to cause blindness. The dassical tools available to the ophthalmologist to limit the inflarnmatory reaction are restricted to two types of drugs: non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and corticosteroids. Both types of drugs are effective and pretty well tolerated in acute inflammatory processes. However, the problem trises when prolonged administration is required, with the consequent emergente of significant local and systemic undesirable effects. The aim of chis paper is to evaluare the use of alpha-1-antitrypsin (A1AT) as an endogenous anti-inflammatory agent.
Objective. To identify the presence of AlAT, a serine protease inhibitor (serpin), in the retina of diabetic and non-diabetic rata.
Methods. On day 2 of life, newborn Wistar rats received an intraperitoneal injection of streptozotodn (STZ). Rata that after 2 days of STZ induction had glucose levels over 200 mg/d1 were classified as diabetic. Groups of four diabetic rata and of four control rata were sacrificed and evaluated at 16 weeks. Protein extracts were obtained from the retinas (control vs. diabetic) in which AlAT expression was analyzed by western blot (WB). For chis assay we used a primary anti-AlAT antibody and anti-GAPDH antibodies as controls. In addition, cross-sections of the remnant retinas were placed on slides for analysis by immu-nofluorescence using the same anti-A1AT antibody.
Result. A1AT protein expression was identified by WB assays in retinal protein extracts from diabetic and non-diabetic rats. No significant differences were observed in the enzyme expression between both groups of rats.
Conclusion. Our investigation has been the first to evidente the presence of A1AT in the retina of diabetic and non-diabetic rats. These results, together with the recent incorporation of AlAT to the treatment of Type 1 diabetes suggest that the role of chis protein in retinal inflammatory processes, such as in diabetic retinopathy, should be studied.
Expressao de alfa-1-antitripsina (AIAT) na retina de ratos diabéticos e náo diabéticos
Introduçao. A retinopatia diabética (RD) é a causa mais frequente de cegueira na populacáo em idade ativa. Os processos inflamatórios sáo relevantes devido á possibilidade de causar cegueira. As ferramentas clássicas das que dispóe o aftalmologista para limitar a reacáo inflamatória estío circunscritas a dois tipos de drogas: os anti-inflamatórios náo esteroides (A1NES) e os corticoides. Ambas as drogas sáo efetivas e suficientemente bem toleradas em processos inflamatórios agudos. Porém, o problema aparece guando for preciso o uso prolongado, surgindo entáo efeitos náo desejados relevantes tanto locais quanta sistImicos. Neste trabalho desejamos avahar a utilizacáo de alfa-1-antitripsina (AIAT) como anti-inflarnatório endógeno.
Propósito. Identificar a presenta da alfa-l-antitrip-sina (A 1AT), um inibidor de serino pro teases (seipin), na retina dos ratos diabéticos e náo diabéticos.
Métodos. No segundo dia de vida, os ratos Wistar neonatos receberam urna injegáo intraperitoneal de estreptozotocina (STZ). Foram classificados como ratos diabéticos aqueles que após 2 dias a partir da inducáo com STZ tinham glicemia maior de 200mg/ dl. Grupos de quatro ratos diabéticos e quatro ratos controle foram sacrificados e analisados após 16 semanas. Foram realizados extratos proteicos a partir das retinas (controle vs. diabéticos) e neles foi analísada a expressáo de AIAT com a técnica de western blot (WB). Para esse ensaio foi utilizado um anticorpo primário anti-A1AT e como controle anticorpos anti-GAPDH. Além disso, cortes transversais das retinas remanentes montaram-se em porta-objetos e foram analisados mediante imunofiuorescéncia, utilizando o mesmo anticorpo anti-A1AT.
Resultado. Nos ensaios de WB foi identificada a expressáo da proteína A1AT em extratos proteicos de retina nos animais diabéticos e náo diabéticos. Náo foram observadas diferencas significativas na expressáo da enzima entre os dois grupos de animais.
Conclusao. Nossa pesquisa mostra pela primeira vez a presenta da A1AT na retina de animais diabéticos e náo diabéticos. Esses resultados junto com a incorporando retente da A1AT no tratamento da diabetes tipo 1 sugerem estudar o papel dessa proteína em processos inflamatórios da retina como é o caso da retínopatia diabética.
La melatonina previene la retinopatía en un modelo experimental de Diabetes mellitus tipo 2 temprana
Miranda M, Salido EM, Bordone M, Chianelli M, Keller Sarmiento MI, Dorfman D, Rosenstein RE
Laboratorio de Neuroquímica Retiniana y Oftalmología Experimental, Deparramento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina, UBA, CEFyBO-CONICET.
magui.miranda@hormail.com
Objetivos. La retinopatía diabética es la principal causa de ceguera adquirida en adultos, en su mayoría afectados por Diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Hemos desarrollado un modelo experimental de DM2 en ratas adultas que reproduce características de la DM2 humana en sus etapas iniciales y provoca alteraciones retinales significativas. El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto de la melatonina sobre los cambios retinales inducidos por la alteración metabólica moderada.
Métodos. Ratas Instar macho adultas recibieron una dieta estándar o 30% de sacarosa en el agua de bebida ad libitum. Tres semanas después de este tratamiento, los animales fueron inyectados con vehículo o estreptozotocina (STZ, 25 mg/kg, i.p.). Dos días después de la inyección de vehículo o STZ se implantó un pellet subcutáneo de 20 mg de melatonina, que se reemplazó cada 15 días. Se examinó la glucemia en ayunas y posprandial y el test de tolerancia intraperitoneal a insulina y a una sobrecarga de glucosa, la función retinal (ERG), la peroxidación lipídica (fluo-rometría), la actividad de NOS (usando 3H-arginina) y los niveles de TNFa (ELISA).
Resultados. A las 12 semanas de tratamiento, los animales que recibieron una dieta rica en sacarosa y STZ mostraron diferencias significativas en las pruebas metabólicas, en comparación con los grupos control. La melatonina, que no afectó el metabolismo glucídico en ratas control o diabéticas, redujo significativamente la disminución en la amplitud de las ondas a y b del ERG y de los potenciales oscilatorios, el aumento de la peroxidación lipídica, la actividad de la NOS, los niveles de TNFct, así como el aumento en los niveles de proteína ácida gliofibrilar en células de Müller y del factor de crecimiento vascular endotelial.
Conclusiones. Estos resultados indican que la melatonina protege a la retina de las alteraciones observadas en un modelo experimental de retinopatía diabética asociada con DM2.
Subsidios. ANPCyT, UBA, CONICET.
Melatonin prevents retinopathy in an experimental model of early type 2 Diabetes mellitus in rats
Objectives. Diabetic retinopathy is the main cause of acquired blindness in adults, most of whom suffer from type 2 Diabetes mellitus (DM2). We have developed an experimental model of DM2 in adult rats that reproduces characteristics of llaman DM2 in its early stages and causes significant retinal disorders. The aim of this paper was to analyze the effect of melatonin on retinal changes induced by moderare metal) o lí c alterarían.
Methods. Adult male Wistar rats received a standard diez or 30% sucrose in drinking water ad libitum. After 3 weeks of this treatment, rats were injected vehicle or streptozotocin (STZ, 25 mg/kg, i.p.). Two days after injection of vehicle or STZ, a subcutaneous pellet of 20 mg of melatonin was implanted, and it was replaced at 15-day intervals. We evaluated: fasting and postprandial glucose levels, intraperitoneal insulin and glucose overload tolerante tests, retinal function (ERG), lipid peroxidation (fluorometry), NOS activity (using 3H-arginine) and TNFu (ELISA).
Results. Twelve weeks after treatment, rats that received a sucroserich diez and STZ evidenced significant differences in metabolic tests vs. control groups. Melatonin, which did not affect glucose metabolism in control or diabetic rats, significantly reduced ERG a- and b- wave amplitude and oscillatory potentials amplitude, the increase in lipid peroxidation, NOS activity, TNFu levels, as well as the increase in the levels of glial fibrillary acidic protein in Müller cells and vascular endothelial growth factor.
Conclusions. These results indicare that melatonin protects the retina from the alterations observed in an experimental model of diabetic retinopathy associated with DM2.
Supports. ANPCyT, UBA, CONICET.
A melatonina evita a retinopatia em um modelo experimental de Diabetes mellitus tipo 2 precoce
Objetivos. A retinopatia diabética é a principal causa de cegueira adquirida em adultos, maiormente afetados por Diabetes rnellitus tipo 2 (DM2). Temas desenvolvído um modelo experimental de DM2 em ratos adultos que reproduz características da DM2 humana em suas fases iniciais e provoca alteracóes retinianas significativas. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito da melatonina sobre as alteracóes retinianas induzidas pela alterarán metabólica moderada.
Métodos. Ratos Wistar macho adultos receberam urna dieta padráo ou 30% de sacarose na água bebida ad libitum. Trés semanas depois deste tratamento, os animais foram injetados com veiculo ou estreptozotocina (STZ, 25 mg/kg, i.p.). Dois Bias depois da injecáo de veículo ou STZ foi implantado um pellet subcutáneo de 20 mg de melatonina, que foi substituido a cada 15 dias. Examinou-se a glicemia em jejum e pós-prandial e o teste de toleráncia intraperitoneal a insulina e a urna sobrecarga de glicose, a funcáo retiniana (ERG), a peroxidacáa lipídica (fluorometria), a atividade de NOS (usando 3H-arginina) e os níveis de TNFct (ELISA).
Resultados. Após 12 semanas de tratamento, os animais que receberam una dieta rica em sacarose e STZ mostraram diferencas significativas nos testes metabólicos, em comparaçao com os grupos controle. A melatonina, que náo afetou o metabolismo glicídico em ratos controle ou diabéticos, reduziu significativamente a diminuicáo na amplitude das ondas a e b do ERG e dos potencias oscilatorios, o aumento da peraxida0o lipídica, a ativídade da NOS, os níveis de TNFct, assim como a aumenta nos níveis de proteína gliofibrilar ácida em células de Müller e do fator de cresdmenro vascular endotelial.
Conclusóes. Esses resultados indicam que a melatonina protege a retina das alteracóes observadas num modelo experimental de retinopatia diabética associada com DM2.
Subsidios. ANPCyT, UBA, CONICET.
Protección de la retina frente al daño isquémico por precondicionamiento hipotérmico
Aranda M, Dorfman D, Bordone M, Chianelli M, Rosenstein RE, Salido EM
Laboratorio de Neuroquirnica Retiniana y Oftalmología Experimental, Departamento de Bioquímica Humana, Facultad deMedicina, LISA, CEFTBO-CONICET.
marcos8877@hotmail.com
Objetivos. La isquemia es un componente central de diversas enfermedades retinales que pueden causar ceguera irreversible. Diversas evidencias indican que la excitoroxicidad por glutamato participa en el daño isquémico retinal. El objetivo de este trabajo fue examinar si un período breve de hipotermia global u ocular, aplicado 24 horas antes de la isquemia (pre-condicionamiento hipotérmico [PCH]) protege a la retina del daño inducido por isquemiaireperfusión y la participación del glutamato en la protección de la retina inducida por PCH.
Métodos. Se indujo isquemia retinal en ratas Wístar macho adultas por aumento de la presión intraocular a 120 mmHg durante 40 minutos. Un día antes de la isquemia, los animales fueron sometidos a hipotermia global (33°C por 20 min, aplicando bolsas de hielo al cuerpo del animal) u ocular (32°C por 20 tilín, a través del flujo de un gel a 13°C) y 14 días después de la isquemia se registraron electrorretinogramas (ERG) escotópicos y se analizó la histología retinal.
Resultados. La isquemia provocó daños funcionales (ERG) e histológicos (espesor total de la retina y número de células ganglionares) significativos que fueron prevenidos por PCH global u ocular. Tres días después de la isquemia, el influjo de glutamato y la actividad de glutannina sin tetasa retinales disminuyeron significativamente, en tanto que el PCH ocular previno significativamente el efecto de la isquemia sobre estos parámetros. La inyección intravítrea de niveles suprafisiológicos de glutamato reprodujo parcialmente las alteraciones electrorretinográficas e histológicas provocadas por la isquemia, que fueron significativamente prevenidas por el PCH ocular.
Conclusiones. Estos resultados sugieren que el PCH global o local provee una protección funcional e histológica significativa frente al daño isquémico retinal a través de un mecanismo dependiente de glutamato.
Subsidios. ANPCyt, UBA, CON ICET.
Retinal protection against ischemic darnage by hypothermic preconditioning
Objectives. Ischemia is a core componenr of different retinal disorders that may cause irreversible blindness. There is plenty of evidence supporting that glutamate-induced excitotoxícity ís involved in rednal ischemic damage. The goal of this paper was to examine whether a short period of global or ocular hypothermia, applied for 24 hours before ischemia (hypothermic preconditioning [HPC]) protects the retina from ischemiaireperfusion-induced damage, and the role of glutamate in HPC-induced retinal protection.
Methods. Retinal ischemia was induced in adule male Wistar rars by increasing intraocular pressure to 120 mmHg for 40 minutes. One day before ischemia, rats underwent global hypothermia (33°C for 20 min, by the application of ice packs ro the rat's body) or ocular hypothermia (32°C for 20 min, via a gel flow at 13°C) and 14 days after ischemia induction, seo topic electroretinograms (ERG) were performed and retinal histology was analyzed.
Results. Ischemia caused significant functional (ERG) and histologic (total retinal thickness and number of ganglion cells) damages that were prevented by global or ocular HPC. Three days after ischemia induction, glutamate inflow and retinal glutamine synthetase activity had decreased significantly, while ocular HPC significantly prevented the effect of ischemia on these parameters. Intravítreal ínjection of supraphysiologic concentrations of glutamate partiaIly mimicked the electroretinographic and histologic alterations produced by ischemia, which were significantly abrogated by ocular HPC.
Conclusions. These resulrs suggest that global or local HPC provides significant functional and histologic pro tection against retinal ischemic damage via a glutamate-dependent mechanism.
Supports. ANPCyt, UBA, CONICET.
Proteçao da retina contra dano isquémico por pré-condicionamento hipotérmico
Objetivos. A isquemia é um componente central de diferentes doeinas retinianas que podem causar cegueira irreversível. Diversas evidencias indicam que a excitoroxicidade por glutamato participa no dano isquémico retiniano. O objetivo deste trabalho foi examinar se um período breve de hipotermia global ou ocular, aplicado 24 horas antes da isquemia (précondicionamento hipotérmico [PCH] ) protege a reti na do dano inducido por isquemia/reperfusáo e a participaçao do glutamato na protecáo da retina induzida por PCH.
Métodos. Foi induzida isquemia retiniana em ratos Wistar macho adultos por aumento da pressáo intraocular a 120 mmHg durante 40 minutos. Um dia antes da isquemia, os animais foram submetidos á hipotermia global (33°C por 20 min, aplicando sacos de gelo no carpo do animal) ou ocular (32QC por 20 min, através do fluxo de um gel a 13°C) e 14 dias depois da isquemia registraran-se eletrorretinogramas (ERG) escotópicos e foi analisada a histología da retina.
Resultados. A isquemia provocou danos funcionais (ERG) e histológicos (espessura total da retina e número de células ganglionares) significativos que foram prevenidos por PCH global ou ocular. Trés dias depois da isquemia, o influxo de glutamato e a atividade de glutamina sintetase da retina diminuíram significativamente, enquanto o PCH ocular evitou significativamente o efeito da isquemia sobre esses parámetros. A injecáo intravítrea de níveis suprafisiológicos de glutamato reproduziu parcialmente as alteracóes eletrorretinográficas e histológicas provocadas pela isquemia, que foram significativamente impedidas pelo PCH ocular.
Conclusóes. Estes resultados sugerem que o PCH global ou local proporciona urna protejo funcional e histológica significativa contra o dano isquémico da retina através de um mecanismo dependente de glutamato.
Subsidios, ANPCyt, UBA, CONICET.
Modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR): caracterización y expresión de IGF-iR
Lorenc VE, Luna ID, Chiabrando GA, Sánchez MC
CIBICI-CONICET, Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba,
vlorenc@fcq.unc.edu.ar
Objetivos. Varias patologías oculares, incluyendo la retínopatía diabética proliferativa (RDP) y la retinaparia del prematuro (ROP), son el resultado de una neovascularización patológica. Diferentes modelos animales, como el de la retinopatía inducida por oxígeno (OIR), han sido desarrollados con el propósito de entender los mecanismos celulares y moleculares que producen estas enfermedades. Uno de los factores de crecimiento involucrados tanto en el desarrollo fisiológico de la vasculatura retinal como en el patológico durante la ROP y RD es el factor de crecimiento simainsulina (IGF-1). Por lo tanto resulta de gran interés poder elucidar el mecanismo de participación del sistema IGF-1/IGF-IR en patologías neovasculares retinales como las antes mencionadas, consideradas por su alta incidencia, de gran importancia en la población argentina.
Materiales y métodos. Utilizamos el método de OIR en ratones que, además de reproducir la ROP, presenta algunas características de la RDP. Para ello, se colocaron ratones C57BL/6 en día posnatal 7 (P7) en una cámara con una concentración de oxígeno constante del 75% durante 5 días. Luego los animales fueron trasladados a la condición de oxígeno normal (21%) por otros 5 días más. Otro grupo de ratones de la misma edad se mantuvieron en oxígeno ambiental (21%) para ser empleados como control. Todos los animales se sacrificaron en p17. Se extrajeron los ojos de los ratones y se fijaron a 4% PFA, seguidos por un gradiente de sucrosa (10 y 30%) y se utilizaron tanto para la obtención de corticoides retinales así como para retinas completas AY- mounts). Con el objeto de identificar neovasos y- localización del sistema IGF-1/IGF-1R se utilizaron diferentes anticuerpos y/o glicoproteínas conjugadas con fluorocromo o biotina. Las imágenes se obtuvieron de un microscopio confocal Olympus Fluoview FV1000.
Resultados. Por hematoxilina eosina observamos la presencia de ovillos neovasculares hacia la cavidad vítrea en retinas de ratón después del tratamiento de oxígeno, los cuales fueron confirmados mediante la utilización de la letrina isolectin B4 (GSA). Dado que este modelo produce estrés a nivel de las células filiales de Müller (gnosis) debido a la hipoxia generada, también se observó la expresión de la proteína acida fibrilar glial (GFPA). Finalmente cuando analizamos la expresión de IGF-1R. a p17 en el modelo OIR, observamos un cambio en la distribución del receptor producido por una modificación en la estructura de la retinal neural.
Conclusión. Los resultados demuestran que hemos podido reproducir en nuestro laboratorio el modelo de OIR y que luego del tratamiento con oxígeno los animales modificaron la expresión IGF1R en la retina neural.
Subsidios y agradecimientos. FONCYT, CONICET, SECYT-UNC.
Oxygen-induced retinopatby (OIR) model: characterization and expression of IGF-1R
Objectives. Several ocular clisorders, including proliferative diabetic retinopathy (PDR) and retinoparhy of prematurity (ROP) are the consequence of pathologic neovascularization. Different animal models, such as that of oxygen-induced retinoparhy (OIR), have been developed with the purpose of understanding the cellular and molecular mechanisms producing these diseases. One of the growth factors involved both in the physiologic and pathologic development of the retinal vasculature during ROP and DR is the insulinlike growth factor (IGF-1). Therefore, ir is of great interest ro elucidare the mechanism by which the IGF-1/IGF-1R is involved in the aboye mentioned neovascular retinal disorders that are considered ro be of grear significante in the Argentinian population due ro their high incidente rases.
Material and methods. We used the OIR method in mice because, in addition ro reproducing ROP, ir has some features of PDR. For such purpose, C57BLIG mice were housed on day 7 post-birth (P7) in a chamber having a constant oxygen concentration of 75% during 5 days. Alter Chis, animals were relocated under normal oxygen. conditions (21%) for 5 additional days. Another group of mice of the same age were housed under environmental oxygen conditions (21%) to serve as controls. All mice were euthanized on P17. Mice eyes were removed and fixed in 4% PFA, followed by a sucrose gradient (10 and 30%), and used both for collection of retinal corticosteroids and complete retinas (flat maulla). In order to identify neovessels and for localizarion of the IGF-1/IGF-1R system, different antibodies and/or conjugated glycoproteins with fluorochrome or biotin were used. Irnages were obran-Led from an Olympus Fluoview FV1000 confocal microscope.
Results. Hematoxylin-eosin staining revealed the presence of neovascular clusters towards the vi treo us cavity in mice retinas after oxygen treatment, which were confirmed by usíng the lectin Grd finja s impiicifolia isolectin B4 (GS-IB4). Since chis model produces stress at the level of the Müller glial cells (gliosis) due to the hypoxia generated, expression of the glial fibrillary acidic protein (GFAP) was also observed. Finally, upan analysis of IGF-IR expression on P17 in the OIR model, we observed a change in the distribution of the receptor caused by a modification in the structure of the neural retina.
Conclusion. The results evidence that we have heen able to reproduce the OIR model in our laboratory and that after treatment with oxygen, mice modified IGF-1R expressíon ín the neural retina.
Supports and acknowledgments. FONCYT, CONICET, S ECYT-UNC.
Modelo de retinopatia induzida por oxigénio (OIR): caracterizaldo e expressito do IGF-IR
Objetivos. Varias patologias oculares, incluindo a retinoparia diabética proliferativa (RDP) e a refinoparia do prematuro (ROP), sao o resultado de urna neovascularizagáo patológica. Diferentes modelos animais, como a retinoparia induzida por oxigénio (OIR), r5m sido desenvolvidos com o propósito de entender os mecanismos celulares e moleculares que produzem essas doencas. Um dos fatores de crescimento envolvidos tanto no desenvolvimento fisiológico da vasculatura retiniana como no patológico durante a ROP e RD é o fator de crescimento insulina símile 1 (IGF-1). Portanto resulta muito interessante poder elucidar o mecanismo de participacáo do sistema IGF-1/IGF-1R em patologias neovaculares retinianas como as mencionadas anteriormente, consideradas pela alta incidéncia, de grande importáncia na populagáo argentina.
Materiais e métodos. Utilizamos o método OIR em ratos que, além de reproduzir a ROP, apresenta algumas caraterísticas da RDP. Para isso, foram colocados ratos C57B116 no dia pós-natal sete (P7) numa cámara com urna concentrnáo de oxigénio constante de 75% durante cinco dias. Depois, os animais foram levados á conclicáo de oxigénio normal (21%) por mais cinco dias. Outro grupo de ratos da mesma idade foi munido em oxigénio ambiental (21%) para ser usados como controle. Todos os animais foram sacrificados em p17. Foram removidos os olhos dos ratos e fixados em 4% PFA, seguidos por um gradiente de sacarose (10 e 30%) e utilizaram-se tanto para a obrencáo de corticoides retinianos bem como para retinas completas (flirt mounts). Com o intuito de identificar neovasos e localizar o sistema IGF-1/ IGF-IR utilizaran-se diferentes anticorpos c/ou glicoproteínas conjugadas com fiuoro cromo ou biotina. As imagens foram obridas por microscópio confocal Olympus Fluoview FV1000.
Resultados. Por hematoxilina eosina observamos a presenta de tufos neovasculares para a cavidade vítrea em retinas de rato depois do tratamento de oxigénio, os quais foram confirmados mediante o uso da lectina Griffonia isolectin B4 (GSA). Dado que esse modelo produz estresse nas células gliais de Müller (gliose) devido á hipóxia gerada, também se observou a expressáo da proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Finalmente guando analisamos a expressáo de IGF-1R a p17 no modelo OIR, observamos urna alteracáo na distribuir n do receptor produzido por urna modificacáo na estrutura da retina neural.
Conclusdo. Os resultados demonstram que foi possível reproducir no nosso laboratório o modelo de OIR e que após o tratamento com oxigénio, os animais modificaran a expressáo IGF 1R na retina neural.
Subsidios e agradecimentos. FONCYT, CONICET, SECYT-UNC.
Los receptores X de los retinoideos par-ticipan en la protección de los fotorreceptores frente al daño oxidativo
German OL, Mónaco S, Agnolazza D, Rotstein N, Politi L
Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca (INI-BIBB-CONICET), Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca
olgerman@cribaedu.ar
Objetivos. En muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina los fotorreceptores (FR) degeneran progresivamente por apoptosis causando ceguera. Los receptores nucleares X de los retinoideos (RXR) forman heterodímeros con miembros de diversas familias de receptores nucleares y podrían intervenir en la regulación de múltiples procesos de la retina. En nuestro laboratorio demostramos que un ligando natural de los RXR —el ácido docosahexanoico (ADH)— promueve la supervivencia de los FR de retina de rata en modelos de neurodegeneración in vitro. Estudiamos aquí la participación de los RXR en la protección de los FR en modelos de neurodegeneración in vitro.
Métodos. Utilizando cultivos neuronales puros de retina de rata analizamos la presencia de los RXR en los FR, mediante inmunocitoquímica y Dot-blot. Investigamos su participación en la protección de los FR frente al daño oxidativo tratando a cultivo neuronales puros de retina con los agonistas HX630 o PA024 de RXR una hora antes de inducir daño oxidativo con. H202 (10 pm). Por otra parte, en el día 3 tratamos a cultivos neuronales suplementados o no con ADH (6,7 am) con los antagonistas HX531 o PA452 a distintas concentraciones, previo al tratamiento con distintos oxidantes (paraquat, PQ 48 pm o H202). Evaluamos la muerte neuronal con ioduro de propidio y la apoptosis mediante el ensayo de TUNEL y la cuantificación de los FR con núcleos fragmentados o picnóticos con la sonda nuclear DAPI.
Resultados. Los FR en cultivo evidenciaron la expresión de los RXR. El tratamiento con agonistas del RXR protegió a los FR del daño oxidativo, disminuyendo el porcentaje de células muertas y FR apoptóticos en los cultivos neuronales sometidos a estrés oxidativo con H202. Por otra parte, antagonistas de los RXR inhibieron el efecto protector del ADH ante la apoptosis inducida con PQ y H202; mientras que el ADH disminuyó el número de FR TLTNEL positivos y con núcleos fragmentados. En presencia de los antagonistas del RXR estos valores fueron semejantes a los de cultivos sometidos al daño oxidativo.
Conclusiones. Estos resultados implican que los RXR participarían en la protección de los FR en diferentes modelos de neurodegeneración in vitro y son la primera evidencia de que la activación de estos receptores es capaz de regular la supervivencia neuronal en la reúna.
Subsidios y agradecimientos. ANCYP, CONICET y UNS.
Retinoid X orphan receptors are required to protect photoreceptors from oxidative stress
Objectives. In many retinal neurodegenerative diseases photoreceptors (PRs) progressively degenerare due to apoptosis, thus causing blíndness. Nuclear retinoid X receptors (RXRs) form heterodimers with members of diverse nuclear receptor families and might have a role in the regularían of multiple retinal processes. In our laboratory, we have demonstrated that a natural RXR ligand -docosahexaenoic acid (DHA)- promotes retinal PR survival in rat models of neurodegeneration in vitro. Here we have evaluated the participation of RXRs in PR protection in neurodegeneration models in vitro.
Methods. The presence of RXRs in PRs was determinad in pure retinal neuronal cultures by immunocytochemistry and Dot-blot. We investigated their role in the protection of PRs against oxidative damage by treating pure retinal neuronal cultures with the RXR agonists HX630 or PA024 one hour before inducing oxidative damage with H202 (10 pm). On the other hand, on. day 3, neuronal cultures, supplemented or no t with DHA (6.7 pm) were treated with different oxidants (paraquat, PQ48 pm or H202). Neuronal death was evaluated with propidium iodine and apoptosís, with the TUNEL assay, while quantitation of PRs with fragmented or pyktonic nuclei was malle with a DAPI nuclear probe.
Results. Cultured PRs evidenced RXR expression. Treatment with RXR agonists protected PRs from oxidative damage, thereby reducing the percentage of dead cells and apoptotic PRs in neuronal cultures that underwent oxidative stress with H202. Furthermore, RXR antagonists inhibited the protective effect of DHA against PQ: and H202-induced apoptosis, while DHA reduced the number of TÚNEL-positive PRs and of those with fragmented nuclei. In the presence of RXR antagonists, these values were similar to those of cultures under oxidative damage.
Conclusions. Th.ese results suggest that RXRs might have a role in the protection of PRs in different neurodegeneration models in vitro and they are the first evidence supporting that activarían of these receptors can regulare neuronal survival in the retina.
Supports and acknowledgments. ANCYP, CONICET and LTNS.
Os receptores X de retinoides participar na prote¡áo dos fotorreceptores contra o dano oxidativo
Objetivos. Em muitas doencas neurodegenerativas da retina os fotorreceptores (FR) degeneram progressivamente por apoptose causando cegueira. Os receptores nucleares X dos retinoides (RXR) formam heterodímeros com membros de diversas familias de receptores nucleares e poderiam intervir na regulay'áo de múltiplos processos da retina. No nos-so laboratorio demostramos que um ligando natural dos RXR —o ácido docosahexanoico (ADH)— promove a sobrevivéncia dos FR de retina de rato em modelos de neurodegeneracao in vitro. Estudamos a participasáo dos RXR na protecáo dos FR em modelos de neurodegeneracáo in vitro.
Métodos. Utilizando culturas neuronais puras de retina de rato analisamos a presenta dos RXR nos FR, mediante imunocitoquímica e Dot-blot. Pesquisamos a sua participacáo na protecáo dos FR contra o dano oxidativo tratando culturas neuronais puras de retina com os agonistas HX630 ou PA024 de RXR urna hora antes de induzir dano oxidativo com H2O2 (10 pm). Por outro lado, no dia 3 tratamos culturas neuronais suplementadas ou náo com ADH (6,7 pm) com os antagonistas HX531 ou PA452 em diferentes concentracóes, previamente ao tratamento com distintos oxidantes (paraquat, PQ 48 pm o H202). Avaliamos a morte neuronal com iodeto de propidio e a apoptose mediante o ensaio de TÚNEL e a quantificacáo dos FR com núcleos fragmentados ou picnóticos com a sonda nuclear DAPI.
Resultados. Os FR em cultura evidenciaram a expressáo dos RXR. O tratamento com agonistas do RXR protegeu os FR do dano oxidativo, diminuindo a porcentagem de células morras e FR apoptóticos nas culturas neuronais submetidos a estresse oxidativo com H202. Por outro lado, antagonistas dos RXR inibíram o efeíto protetor do ADH contra a apoptose inducida com PQ e H2O2; enquanto o ADH diminuiu o número de FR TÚNEL positivos e com núcleos fragmentados. Em presenta dos antagonistas do RXR, esses valores foram semelhanres ás culturas submetidos ao dano oxidativo.
Conclusóes. Esses resultados implicam que os RXR participariam na protecáo dos FR em diferentes modelos de neurodegeneracáo in vitro e sito a primeira evidencia de que a ativacáo desses receptores pode regular a sobrevivIncia neuronal na retina.
Subsidios e agradecimentos. ANCYP, CONICET e UNS.
La exposición a un ambiente enriquecido protege a la retina del daño por glutamato
Dorfman D, Fernández DC, Rosenstein. RE
Laboratorio de Neuroquitnica Retiniana y Oftalmología Experimental, Departamento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, CEEyBO-CONICET
damiandorfmangsmail.com
Objetivos. La excitotoxicidad inducida por aumento en los niveles de glutamato se ha asociado a diversas enfermedades que constituyen causas frecuentes de ceguera. Recientemente hemos demostrado que la exposición de ratas adultas a un ambiente enriquecido (AE) protege a la retina del daño isquémico. Considerando que el aumento en los niveles de glutamato juega un rol central en el daño isquémico retinal, el objetivo de hoppers, wheels and objects of different shapes, textu este trabajo fue analizar el efecto de la exposición a un AE frente al daño retinal inducido por glutamato.
Métodos. Se inyectó una solución de glutamato en la cámara vítrea de un ojo de ratas Wistar macho adultas y vehículo en el ojo contralateral. Luego los animales se albergaron en un ambiente estándar (AS) o AE por siete días. El AE consistió en jaulas grandes (100 x 50 x 82 cm) conteniendo varias tolvas de alimento, ruedas y objetos de distintas formas, texturas y colores que se reposicionaron una vez por día. Luego de 7 días de exposición a AE o AS se analizó la función (por electrorretinograffa, ERG), la histología y la reactividad glial (inmunomarcación de la proteína gliofibrilar ácida [GFAP]} retinales, así corno el transporte anterógrado de la subunidad 13 de la toxina del cólera (CTB) desde la retina al colículo superior (CS).
Resultados. En animales expuestos a un AS, el glu-tamato indujo una caída significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG y en el número de células ganglionares retinales (CGR), aumento en la inmu-nomarcación para GFAP y disminución en la densidad de proyecciones retinales al CS. La exposición a AE revirtió significativamente la disfunción retinal, la disminución en el número de CGR, el aumento en los niveles de GFAP y protegió el transporte activo entre la retina y el CS.
Conclusiones. Estos resultados sugieren que la exposición a un AE podría constituir una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento del daño retinal inducido por excitotoxicidad glutamatérgica.
Subsidios. ANPCYT, UBA, CONICET.
Enriched environment housing protects the retina against glutamate-induced injury
Objectives. Excitotoxicity induced by an increase in glutamate levels has been associated with several diseases that are common causes of blindness. Recently, we have demonstrated that exposure of adult rats to an enriched environment (EE) protects the retina from ischemic injury. Based on the fact that increased glutamate levels have a core role ín retinal ischemic injury, the goal of chis paper was to analyze the effect of exposure to an EE against glutamate-induced retinal injury.
Methods. A glutamate solution was injected into the vitreous chamber of one eye of adult male Wistar rats, while vehicle was injected into the fellow eye. Mice were subsequently housed in a standard environment (SE) or EE for seven days. The EE featured large cages (100 x 50 x 82 cm) containing severa' food res and colors that were repositioned once daily. After 7 days of exposure to an EE and SE we analyzed retinal function (by electroretinography, ERG), histology and glial reactivity (immunomarking of the glial fibrillary acídic protein, GFAP), as well as anterograde transport of the cholera toxin [3 subunit (CTB) from the retina to the superior colliculus (SC).
Results. In animals exposed to a SE, glutamate induced a significant drop in ERG a- and b-wave amplitudes and in the number of retinal ganglion cells (RGCs), an increase in immunomarking for GFAP and a reduction in the density of retinal projections to the SC. Exposure to an. EE significantly reversed retinal dysfunction, the reduction in the number of RGCs and the increase in GFAP levels; in addition, it pro tected active transport between the retina and the SC.
Conclusions. These results suggest that exposure to an EE might be a novel therapeutic strategy for the treatment of glutamatergic excitotoxicity.
Supports. ANPCYT, UBA, CONICET
A exposiçao a um ambiente enriquecido protege a retina contra danos pelo glutamato
Objetivos. A excito toxicidade induzida por aumento nos níveis de glutamato tem sido associada a diversas doencas que sáo causas frequentes de cegueira. Recentemente, ternos demonstrado que a exposicáo de ratos adultos a um ambiente enriquecido (AE) protege a retina do dano isquémico. Considerando que o aumento nos níveis de glutamato tem um papel central no dano isquémico retiniano, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito da exposiçao a um AE contra o dano retiniano inducido por glutamato.
Métodos. Foi injetada uma solucáo de glutamato na cámara vítrea de um olho de rato Wistar macho adulto e veículo no olho contralateral. Depois, os animais foram acomodados em um ambiente padráo (AP) ou AE por sete dias. O AE consistiu em grandes gaiolas (100 x 50 x 82 cm) contendo varias tremonhas de alimento, rodas e objetos de diferentes formas, texturas e cores que foram reposicionados urna vez por dia. Após sete dias de exposicáo a AE ou AP foi analisada a funcáo (por eletrorretinografia, ERG), a histologia e a reatividade glial (imunomarcacáo da proteína gliofibrilar ácida [GFAP]) retiniana, assim como o transporte anterógrado da subunidade 13 da toxina do cólera (CTB) desde a retina até o colículo superior (CS).
Resultados. Em animais expostos a um AP, o glutamato induziu urna queda significativa na amplitude das ondas a e b do ERG e no número de células ganglionares retinianas (CGR), aumento ria imunomarcacáo para GFAP e diminuicáo na densidade de projeçoes retinianas ao CS. A exposig'áo ao AE reverteu significativamente a disfuncáo retiniana, a diminuicáo no número de CGR, o aumento nos niveis de GFAP e protegeu o transporte ativo entre a retina e a CS.
Conclusóes. Esses resultados sugerem que a exposicáo a um AE poderia constituir urna nova estratégia terapéutica para o tratamento do dano retiniano induzido por excitotoxicidade glutamatérgica.
Subsidios. ANPCYT, UBA, CONICET.
Adaptación de equipo de adquisición de señales Biopac NiPiso como electrorretinógrafo estándar
Quinteros ML, Benedetto M, Vera de Payer E, Confin MA
Laboratorio de Procedimientos de Señales, FCEFYN, Universidad Nacional de Córdoba
CIQUIBIC (CONICET), Departamento de Química Bioló-gica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba
mluzqq@hotmail.com
Introducción. Las electrorretinografías (ERG) son registros de biopotenciales retinales que permiten conocer el estado funcional de la retina y sus componentes celulares. Estas señales tienen dos parámetros importantes: 1) la amplitud de la señal, la cual puede variar desde "cero" a unos pocos cientos de microvoltios (pV) y 2) tiempos de latencia que corresponde al tiempo en el cual las células fotorreceptoras emiten respuesta frente a estímulos lumínicos medidos en el orden de milisegundos (ms). En estados patológicos ambos parámetros se ven afectados. Para que las señales puedan ser estudiadas deben ser acondicionadas, aumentando sus niveles de amplitud antes y después de la etapa de filtrado, el cual es necesario para reducir el ruido que se introduce en el proceso de adquisición de la señal. Debido a que la amplitud del biopotencial retinal disminuye notablemente con la enfermedad, se hace imprescindible que el acondicionamiento de la señal se realice en forma correcta cuidando de no perder información relevante.
Los cambios en los parámetros pueden estudiarse en modelos animales con degeneraciones retinales.
Objetivos. Adquirir y preacondicionar señales de ERG con un equipo comercial de adquisición de señales Biopac MP 150 y software AcqKnowledge 4.1 para verificar si éste puede ser utilizado como electrorretinógrafo en estudios de degeneración retinal en ratas Wistar bajo protocolos internacionales.
Métodos. Las señales se adquirieron en ratas albinas Wistar con funciones retinales normales. Los animales se sometieron a anestesia con 200 ul/100g de peso corporal de quetamina-xilacina (3 partes de quetamina por 1 de xilacina); la dilatación pupilar se logró con colirio de tropicamida y se utilizó un ungüento anestésico tópico. El equipo cuenta con un sistema de pre-amplificación y filtrado diseñado para trabajar con señales de electrorretinografias con ganancias de amplificación de hasta 10.000 veces y filtro pasabanda de 0.3 a 300 hz. Se diseñó un fotoestimulador a base de LEDs de alta potencia, 12V-1A sincronizado con el Biopac.
Resultados. Los resultados muestran que con el equipo utilizado se cubrieron las especificaciones de protocolos internacionales, en particular de la ISCEV.
Conclusiones. Podemos concluir que el Biopac MP150, con las adaptaciones del fotoestimulador y el pre-amplificador realizadas, es un equipo óptimo para registrar ERG.
Adaptation of the Biopac MP150 signal acquisition system as a standard ekctroretinograpby system
Introduction. Electroretinographies (ERGs) are records of retinal biopotentials by which the functional status of the retina and its cellular components can be known. These signals have two important parameters: 1) signal amplitude, which can range from zero to a few microvolts (pV), and 2) latency times, i.e. the time during which photoreceptor cells respond to light stimuli, measured on the order of milliseconds (ms). In pathologic states both parameters are affected. For signals to be studied they have to be conditioned by increasing their amplitude levels before and alter the filtering stage, which is necessary to reduce the noise introduced in the process of signal acquisition. Since the retinal biopotential amplitude decreases markedly with the dísease, signal condiríaning must be performed correctly so as not to miss relevan t información.
Changes in parameters can be studied in animal rnodels with retinal degenerations.
Objectives. To acquire and precondition ERG sig nals with a commercial signal acquisition device, Biopac MP150, and Acq1Cnowledge 4.1 software in arder to verify if it can be used as an electroretino-graph in retinal degeneration studies in Wistar rats according to internacional protocols.
Metbods. Signals were acquired from Wistar albino rats with normal retinal functions. Rats were anesthetized with 200 [11/100 g of body weight of ketamine-xylazine (3 parís ketamine I- 1 parí xylazine); pupillary dilation was induced with tropicamide eyedrops and topical anesthetic ointment was used. The device features a pre-amplification and filtering system designed to work with electroretinographic signals with amplification gains of up to 10,000 times and a bandpass filter of 0.3 to 300 hz. A photostimulator was designed based on high-potency LEDs, 12V-1A, synchronized with the Biopac.
Results. The results evidence that the system used covered the specifications of internacional protocols, particularly of the ISCEV.
Conclusions. It might be concluded that the Biopac MP150, with its photostimulator and pre-amplifier adapted as described aboye, is an oprimal system for ERG.
Adaptaçao do equipamento de aquisifáo de sinais Biopac MP150 como eletrorretinógrafo padrao
Introduçao. As eletrorretinografias (ERG) silo registros de biopotenciais retinianos que permitem conhecer o estado funcional da retina e setas componentes celulares. Esses sinais tém dois parámetros importantes: 1) a amplitude do sinal, que pode variar desde "zero" até algumas centenas de microvolts (pV) y 2) tempos de laténcia, que corresponde ao tempo no qual as células fotorreceptoras emitem resposta a estímulos luminosos, mediados na ordem de milissegundos (ms). Em estados patológicos ambos os pará-metros silo afetados. Para que seja possível estudar os sinais será preciso ajustó-los, aumentando seus níveis de amplitude antes e depois da fase de filtragem necessária para reduzir o ruido introduzido no processo de aquisiçao do sinal. Devido a que a amplitude do biopotencial da retina diminui notavelmente com a doenca, resulta imprescindível que o ajuste do sinal seja realizado corretamente cuidando de náo perder informacáo relevante.
As mudam;as nos parámetros podem ser escudadas em modelos animais com degeneracóes retinianas.
Objetivos. Adquirir e ajustar previamente os sinais de ERG com um equipamento comercial de aquisicáo de sinais Biopac MP150 e software AcqKnowledge 4.1 para verificar se ele pode ser utilizado como eletrorretinógrafo em estudos de degeneracáo retiniana em ratos Wistar sob protocolos internacionaís.
Métodos. Os sinais foram adquiridos em ratos albinos Wistar com funcñes retinianas normais. Os animais foram submetidos a anestesia com 200 p1/ 100g de peso corporal de quetamina-xilazina (3 partes de quetamina por 1 de xilazina); a dilatacáo pupilar foi obtida com colirio de tropicamida e foi utilizado um unguento anestésico tópico. O equipamento tem um sistema de pré-amplificasáo e filtragem projetado para trabalhar com sinais de eletrorretinografias com ganhos de amplificacáo de até 10.000 vezes e filtro passafaixa de 0.3 a 300 hz. Projetou-se um foto-estimulador baseado cm LEDs de alta poténcia, 12V-1A sincronizado com o Biopac.
Resultados. Os resultados mostram que com o equipamento utilizado foram cobertas as especificacies de protocolos internacionais, em particular da ISCEV.
Conclusóes. Podemos concluir que o Biopac MP150, com as adaptaçoes do foto-estimulador e do pré-amplificador realizadas, é um equipamento ótimo para registrar ERG.
Interacción entre las células gliales de Müller y las neuronas fotorreceptoras en ratones portadores de una degeneración retinal
Volonté YA, Simón MV, Germán OL, Rotstein NP, Politi LE
Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca (INIBIBB-CONICET), Universidad Nacional del Sur, Babia Blanca
yvolonte@criba.edu.ar
Objetivos. Las enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la retinitis pigmentosa, se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de neuronas fotorreceptoras. Para investigar las causas y los posibles tratamientos para esta enfermedad resulta útil contar con un modelo animal donde los fotorreceptores (FR) sean afectados por un proceso degenerativo similar al que ocurre en esta enfermedad, como los ratones 'rd". Estudios previos de varios laborato ríos incluyendo el nuestro, demuestran el rol de las células gliales de Müller (CGM) en la supervivencia y desarrollo de los FR. Recientemente establecimos que las CGM inducen la transformación de células progenitoras de retina en células madre multipotentes, las cuales luego pueden diferenciarse como FR, sugiriendo que las CGM podrían contribuir a regenerar los FR en los procesos degenerativos de la retina. Si bien se han estudiado intensivamente las causas de la retinitis pigmentosa, el rol de las células gliales y sus posibles alteraciones en esta patología están aún inexplorados. Investigamos ahora el desarrollo de las CGM de ratones "rd" y sus interacciones con los FR de retina.
Métodos. Utilizamos cultivos mixtos neurogliales obtenidos de retinas de ratones "rd" de dos días. Los cultivos se fijaron a distintos tiempos de desarrollo y analizados para determinar la muerte de los FR, utilizando la sonda nuclear DAPI y la progresión en ciclo celular, midiendo la incorporación de Br deoxiuridina (BrdU) y la expresión del filamento intermedio nestina como marcador de células madre multipotentes.
Resultados. Las CGM proliferan activamente incorporando BrdU en forma aparentemente normal. Sin embargo, mientras en CGM de retina de rata la expresión de nestina se mantiene homogénea durante tiempos prolongados en cultivo, en CGM de retinas rd dicha expresión no fue homogénea y en muchos casos perdió su patrón filamentoso. El cocultivo con CGM no logró evitar la apoptosis neuronal: el porcentaje de FR "rd" apoptóticos aumentó progresivamente desde un 5% a un 50% entre los días 8 y 16, en forma similar a lo que ocurre en la retina in vivo.
Conclusiones. Nuestros resultados preliminares sugieren que además de los defectos ya demostrados para los FR en ratones "rd", las CGM podrían presentar alteraciones que influirían en la muerte de FRs.
Subsidios. FONCYT, CONICET Y UNS.
Interaction between Müller glial cells and pho-toreceptor neurosis in mice with a retinal degeneration
Objectives. Retinal neurodegenerative diseases, such as retinitis pigmentosa, are characterized by progressive and irreversible loss of photoreceptor neurons. For the investigation of the causes and possible treatments for this disease, an animal model, such as "rd" mice, in which photoreceptors (PRs) are affected by a degenerative process similar to the one occurring in this disease, is useful. Previous studies from severa' laboratories, including ours, demonstrate the role of Müller glial cells (MGCs) in PR survival and development. We have recently established that MGCs induce the transformation of retinal progenitor cells into multipotent stem cells, which can subsequently differentiate as PRs, thus suggesting that MGCs might contribute to PR regeneration ín retinal degenerative processes. Though the causes of retinitis pigmentosa have been investigated extensively, the role of glial cells and their possible alterations in chis disease still remain to be elucidated. We have investigated the development of MGCs of "rd" mice and their interactions with retinal PRs.
Methods. We have used mixed neuroglial cultores obtained from retinas of 2-day "rd" mice. Cultures were fixed at different development time-points and analyzed to determine PR death, using the DAPI nuclear probe whereas progression of the cellular cycle was evaluated by measuring the incorporation of Br-deoxy-uridine (BrdU) and the expression of the intermediare filament nestin as a marker of multipotent stem cells.
Results. MGCs proliferare actively with apparently normal BrdU incorporation. However, while in rat retinal MCC nestin expression remains homogeneous for long times in culture, in retinal MGCs from rd mice this expression was not homogeneous and, in many cases, the filamentous pattern was lost. Co-culture with MGCs failed to prevent neuronal apoptosis: the percentage of apoptotic "rd" PRs increased pro¬gressively from 5% to 50% between days 8 and 16, similarly to what has been observed in retinas in vivo.
Conclusions. Our preliminary results suggest that, in addition to the defects already demonstrated for PRs in "rd" mice, MGCs might have alterations influencing PR death.
Supports. FONCYT, CONICET and UNS.
Interafáo entre as células gliais de Midler e os neurónios fotorreceptores em ratos portadores de degesierafá o retiniana
Objetivos. As doencas neurodegenerativas da retina como a retinite pigmentosa, caracterizam-se pela perda progressiva e irreversivel de neurónios fotorreceptores. Para pesquisar as causas e possíveis tratamentos para essas doeNas é útil ter um modelo animal em que os fotorreceptores (FR) sejam afetados por um processo degenerativo semelhante ao que ocorre nesta doenca, como os ratos "rd". Escudos prévios de vários laboratórios incluindo o nosso, demonstram o papel das células gliais de Müller (CGM) na sobrevivéncia e desenvolvimento dos FR. Recen temente estabelecemos que as CGM induzem a transformacáo de células progenitoras de retina em células-tronco multipatentes, as quais padem se diferenciar depois como FR, sugerindo que as CGM poderiam contribuir na regeneracáo das FR nos processos degenerativos da reúna. Embora tenham sida estudadas intensivamente as causas da retinite pigmentosa, o papel das células gliais e suas possíveis alterasóes nesta patologia estío ainda inexploradas. Pesquisamos agora o desen-volvimento das CGM de ratos "rd" e suas interacóes com os FR de retina.
Métodos. Utilizamos culturas mistas neurogliais obridas de retinas de ratos "rd" de dois días. As culturas forarn fixadas em diferentes tempos de desenvolvimen¬to e analisadas para determinar a morte dos FR., utilizando a sonda nuclear DAPI e a progressáo em ciclo celular, medinclo a adicáo de Br desoxiuridina (BrdU) e a expressáo do filamento intermediário nestina como marcador de células-tronco multipotentes.
Resultados. As CGM proliferam ativamente in-corporando BrdU em forma aparentemente normal. No entanto, enquanto em CFM da retina de rato a expressáo de nestina permanece homogénea durante tempos prolongados em cultura, em CGM de retinas rd, essa expressáo náo foí homogénea e em mui tos casos perdeu seu padráo filamentoso. A co-cultura com CGM nio evitou apoptase neuronal: a porcentagem de FR 'rd" apoptóticos aumentou progressivamente desde 5% até 50% entre os días 8 e 16, em forma semelhante ao ocurrido na retina in vivo.
Conclusóes. Nossos resultados preliminares sugerem que, além dos defeítos já demonstrados para os FR em ratos "rd", as CGM poderiam apresentar alte-rasóes que influiriam na morte de FRs.
Subsidios. FONCYT, CONICET e UNS.
El receptor endotelinérgico de tipo A (ETA) estaría involucrado en la transmisión intrarretinal de los estímulos visuales
Bermúdez V, Suburu AM
Facultad de Ciencias Biornédicas, Universidad Austral, Pilar (Buenos Aires).
ybermude@cas.austral.edu.ar
Objetivo. Previamente demostramos la presencia de ETA en el terminal sináptico de los fotorreceptores (FR). Asimismo, el bloqueo de ETA mediante clazosentan aumenta la pérdida de FR en los anima les expuestos a niveles tóxicos de luz. Investigamos el posible papel de ETA en la transmisión de estímulos visuales mediante: a) detección de marcadores de los terminales sinópticos después de exposición breve a estímulos fototóxicos en presencia o ausencia de dazosentan, y b) activación de c-Fos después de exposición a estímulos luminosos fisiológicos en presencia o ausencia de clazosentan.
Metodología. Se emplearon ratones Balb-c (machos, 5-7 semanas). Los niveles fototóxicos fueron 1500 lux por 2 días. Los estímulos no fototóxicos fueron de 0.3 lux a 2 Hz durante 60 minutos. Se estudiaron grupos controles y sometidos a iluminación, con o sin clazosentan (10 mg/kg/día). Después de la exposición, los animales fueron sacrificados y sus ojos procesados para la detección inmunohistoquímica de la proteína sinóptica PSD95 y c-Fos (n=3).
Resultados. Clazosentan aumentó la PSD95-IR y apareció en la CPE de animales sometidos a iluminación estándar. También aumentó PSDS-IR en los animales expuestos a iluminación fototóxica, tanto en ausencia como en presencia de clazosentan. En los animales controles mantenidos en oscuridad prácticamente no se encontraron núcleos retinales marcados con c-Fos. La exposición a iluminación estroboscópica indujo la aparición de c-Fos en la capa nuclear interna (CNI) y, en menor número, en la capa gan-glionar (CG). El número de núcleos activados aumentó significativamente en las retinas estimuladas después de la administración de clazosentan.
Conclusiones. El aumento de PSD95-IR observa-do después de clazosentan o estimulación fototóxica sugiere cambios en las estructuras presinápticas de los FR. Estas modificaciones podrían asociarse con la modulación de la transmisión sinóptica en la retina externa. Para verificar esta hipótesis se realizaron experimentos de activación de c-Fos en retinas con iluminación no fototóxica. El número de núcleos c-Fos+ en la retina interna, que constituye una medida de la activación de la CPE, fue mayor en los animales tratados con clazosentan que en los controles. Postulamos entonces que los receptores ETA de los fotorreceptores podrían modular la transmisión de impulsos entre la retina externa y la retina interna.
Subsidios. PICTO-Austral, 2008-00090.
The endothelin receptor A (ETA) might be involved in intraretinal transmission of visual stimuli
Objective. We have previously established the presence of ETA in the synap tic terminal of photoreceptors (PR). Furthermore, ETA blackade by means of clazosentan increases photoreceptor loss in animals exposed to toxic light levels. We have investigated the possible role of ETA in the transmission of visual stimuli by means ofi a) detection of synaptic terminal markers after brief exposure to phototoxic stimuli in the presence or absence of clazosentan, and b) c-Fos activation after exposure to physiologic light stimuli in the presence or absence of clazosentan.
Methodology. Balb-c mice (5-7-week males) were used. Phototoxic levels were 1500 lux for 2 days. Non-phototoxic stimuli were 0.3 lux at 2 Hz for 60 minutes. We also evaluated control groups subjected to light with or without clazosentan (10 mg/kg/day). After exposure, animals were euthanized and their eyes were processed for immunohistochemical detection of the synaptic protein PSD95 and c-Fos (n = 3).
Results. Clazosentan increases PSD95-IR and appeared in the CPE of animals that underwent standard illumination. It also increased PSDS-IR in those exposed to phototoxic illumination, both in the absence and in the presence of clazosentan. In control animals kept in the dark almost no c-Fas-marked retinal nuclei were found. Exposure to stroboscopic illumination induced the appearance of c-Fos in the inner nuclear layer (INL) and, to a lesser extent, in the glanglion layer (GL). The number of activated nuclei increased significantly in the retinas stimulated after clazosentan administration.
Conclusions. PSD95-IR increase observed after dazosentan administration or phototoxic stimulation suggests changes in the presynaptic structure of PRs. These changes might be associated with modulation of synaptic transmission in the outer retina. C-Fos activation experíments were performed in retinas with or without phototoxic illumination in order ro validate Chis hypothesis. The number of c-Fos(+) nuclei in the inner retina, the mensure of CPE activation, was hígher in animals treated with. clazosentan than in controls. We therefore postulate that ETA receptors of photoreceptors might modulare impulse transmission between the outer and inner retina.
Supports. PICTO -Austral, 2008-00090
O receptor endotetinérgico de tipo A (ETA) estaría envolvido na transmissao infraretiniana dos estímulos visuais
Objetivo. Previamente ternos demonstrado a preseng de ETA no terminal sinóptico dos fotorreceptores (FR). Também que o bloqueio de ETA mediante clazosentan aumenta a perla de FR nos animais expostos a níveis tóxicos de luz. Pesquisamos o possível papel de ETA na transmissáo de estímulos visuais mediante: a) deteccáo de marcadores dos terminais sinópticos depois de exposiçao breve a estímulos fototóxicos em preserva ou ausénda de clazosentan, e b) ativacáo de c-Fos de-pois de exposicáo a estímulos luminosos fisiológicos em presenta ou ausencia de clazosentan.
Metodología. Foram usados ratos Balb-c (machos, 5-7 semanas). Os níveis fototóxicos foram 1500 lux por dais dias. Os estímulos náo fototóxicos foram de 0.3 lux a 2 Hz durante 60 minutos. Foram estudados grupos controle e submetidos a ilurninagáo, como ou sem clazosentan (10 mg/kg/dia). Depois da exposícáo, os animais foram sacrificados e seus olhos processados para a deteccáo imunohistoquímica da proteína sinóptica PSD95 e c-Fos (n=3).
Resultados. Clazosentan aumentou a PSD95-IR e apareceu na CPE de animais submetidos a iluminacáo padráo. Também aumentou PSDS-IR nos animais expostos a iluminarlo fototóxica, tanto em ausencia como em presenca de clazosentan. Nos animais controle mantidos na escuridáo quase náo foram achados núcleos retinais marcados com c-Fos. A exposiclo
estroboscópica induziu aparecimento de c-Fos na carnada nuclear interna (CNI) e, em menor número, na carnada ganglionar (CG). O número de núcleos ativados aumentou significativamente nas retinas estimuladas depois da administracáo de clazosentan.
Conclusóes. O aumento de PSD95-IR observado depois de clazosentan ou estimulacáo fototóxica sugere alteracóes nas estruturas pré-sinápticas dos FR. Essas alternóes poderiam associar-se com a modulacáo da transmissáo sinóptica na retina externa. Para verificar essa hipó cese foram realizados testes de ativacáo de c-Fos em retinas com ilurninnáo náo fototóxica. O número de núcleos c-Fos+ na retina interna, que constitui urna medida da ativacáo da CPE, foi maíor nos animais tratados com clazosentan que nos controles. Postulamos entáo que os receptores ETA dos fotorreceptores poderiam modular a transmissáo de impulsos entre a retina externa e a retina interna.