Tratamiento de queratitis micótica por Fusarium con crosslinking corneal

Título

Tratamiento de queratitis micótica por Fusarium con crosslinking corneal

Autor

Gustavo Galperin
Martin Berra
Julia Tau
Gabriela Boscaro
Jorge Zarate
Alejandro Berra

Correspondencia

martinberra81@hotmail.com

Texto

Oftalmol Clin Exp (ISSN 1851-2658) 2012; 5(3): 102-107.

Tratamiento de queratitis micótica por Fusarium con crosslinking corneal

Gustavo Galperina,c, Martin Berraa,c, Julia Taua, Gabriela Boscarob, Jorge Zaratea y Alejandro Berraa

aLaboratorio de Investigaciones Oculares, Buenos Aires.
bBioFundus, Buenos Aires.
cHospital Pedro Lagleyze, Buenos Aires.

Resumen
Objetivo: Evaluar la eficacia de crosslinking corneal (riboflavina/luz ultravioleta A) como una modalidad terapéutica en la queratitis por hongos del género Fusarium.
Métodos: Veinticuatro conejos fueron anestesiados sistémicamente y luego inoculados en el estroma de la córnea derecha con una suspensión de Fusarium solani (105 unidades formadoras de colonias [UFC] /m1). Los conejos se dividieron en dos grupos: uno fue tratado con crosslinking corneal (CXL) 72 horas después de la infección y el otro no recibió ningún tratamiento (control). Todos los ojos de ambos grupos fueron examinados antes del CXL (días O y 3) y después del mismo (día 7). Los ojos fueron enucleados y los botones corneales fueron enviados para su análisis microbiológico y anatomopatológico.
Resultados: Todos los animales desarrollaron queratitis por Fusarium, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos antes del tratamiento (día 0, p = 0,397 y el día 3, p = 0,702). Después del tratamiento con CXL, la diferencia en los resultados clínicos en el día 7 entre los grupos fue estadísticamente significativa (p < 0,001), el grupo CXL mostró el puntaje clínico más bajo. El grupo CXL presentó 22,45 ± 5,09 UFC/g y el grupo control 42,5 ± 3,12 UFC/g, esta diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0,01). En los tres botones del grupo control se observó una cantidad similar de hifas de Fusarium y células inflamatorias. En dos de los tres botones de análisis del grupo CXL se observaron menor cantidad de hifas de Fusarium y células inflamatorias en comparación con el grupo control.
Conclusiones: El tratamiento de la queratitis por hongos con CXL parece ser eficaz en la disminución de la intensidad y la severidad de la queratitis infecciosa por E solani. Por lo que concluimos que el CXL puede ser útil como tratamiento coadyuvante al tratamiento médico en infecciones resistentes.
Palabras clave: córnea, crosslinking, Fusarium solani, queratitis, riboflavina.

Treatment of fung

al keratitis from Fusarium infection by corneal cross-linking

Abstract
Purpose: To evaluate the efficacy of corneal cross-linking (CXL) (riboflavin—UV-A) as a simple therapy in Fusarium keratitis.
Methods: Twenty-four rabbits were systemically anesthetized, and the stromata of their right corneas were inoculated with Fusarium solani [105 colony-forming units (CFU) per milliliter]. Rabbits were divided into 2 groups: one was treated with CXL 72 hours after infection and the other did not receive any treatment (control). All eyes in both the groups were examined before (days O and 3) and after (day 7) CXL treatment. The eyes were enucleated, and corneal buttons were sent for microbiological and histological examinations.
Results: All animals developed Fusarium keratitis; there was no statistically significant difference between groups before treatment (day O, P = 0.397 and day 3, P = 0.702). After CXL treatment, the difference in clinical scores on day 7 between groups was statistically significant (P = 0.00); the CXL group showed significant lower clinical score. The CXL group had 22.45 6 5.09 CFU/g compared with 42.5 6 3.12 CFU/g in the control group; this difference was statistically significant (P = 0.01). In the 3 buttons of the control group, similar amounts of Fusarium hyphae and inflammatory cells were observed. In 2 of the 3 buttons analyzed from the CXL group, fewer Fusarium hyphae, inflammatory cells, and nonspecific stromal changes were observed compared with the control group.
Conclusions: Treatment of fungal keratitis with CXL seems ro be effective in decreasing the intensity and severity of infectious keratitis by E solani. This therapy may be useful as a coadjuvant in the medical treatment of resistant infections.
Keywords: cornea, cross-linking, Fusarium solani, keratitis, riboflavin-UV-A.

Tratamento de ceratite micótica por Fusarium com crosslinking corneano

Resumo
Objetivo: Avahar a eficácia do crosslinking corneano (riboflavina/luz ultravioleta A) como uma modalidade terapéutica na ceratite por fungos do género Fusarium.
Métodos: Vinte e quatro coelhos foram anestesiados sistematicamente e depois inoculados no estroma da córnea direita com uma suspensáo de Fusarium solani (105 unidades formadoras de colónias [UFC] /m1). Os coelhos dividiram-se em dois grupos: um foi tratado com crosslinking corneano (CXL) 72 horas depois da infecsáo e o outro náo recebeu nenhum tratamento (controle). Todos os olhos de ambos os grupos foram examinados antes do CXL (dias 0 e 3) e depois do mesmo (dia 7). Os olhos foram enucleados e os botóes corneais foram enviados para uma análise microbiológica e anatomopatológica.
Resultados: Todos os animais desenvolveram ceratite por Fusarium, náo houve diferencias estatisticamente significativas entre os grupos antes do tratamento (dia 0, p = 0,397 e o dia 3, p = 0,702). Depois do tratamento com CXL, a diferensa nos resultados clínicos no dia 7 entre os grupos foi estatisticamente significativa (p < 0,001), o grupo CXL mostrou a PONTAGEM clinico menor. O grupo CXL apresentou 22,45 ± 5,09 UFC/g e o grupo controle 42,5 ± 3,12 UFC/g, essa diferencia foi estatisticamente significativa (p = 0,01). Nos trés botóes do grupo controle observou-se uma quantidade similar de hifas de Fusarium e células inflamatórias. Em dois dos trés botóes de analise do grupo CXL observaram-se menor quantidade de hifas de Fusarium e células inflamatórias em comparasáo com o grupo controle.
Conclusóes: O tratamento da ceratite por fungos com CXL parece ser eficaz na diminui0o da intensidade e a severidade da ceratite infecciosa por E solani. Pelo que concluímos que o CXL pode ser útil como tratamento coadjuvante ao tratamento médico em infecOes resistentes.
Palavras chave: córnea, crosslinking, Fusarium solani, ceratite, riboflavina.

Autor responsable: Martín Berra
Uriburu 950, entrepiso,
1114 Buenos Aires
martinberra81@hotmail.com

Introducción
Las infecciones corneales tienen un profundo impacto en la calidad visual de la población, siendo hoy en día una importante causa de ceguera que requiere de un tratamiento quimioterápico o quirúrgico adecuado para preservar la visión1.
En la actualidad existe una importante variedad de antimicrobianos que nos permiten tratar adecuadamente los diferentes tipos de infecciones corneales; sin embargo, debido a la creciente resistencia que desarrollan los gérmenes2-5 —siendo el caso más reciente el de las fluoroquinolonas6-9 , las infecciones pueden seguir progresando y requerir de tratamientos más agresivos para intentar su curación.
Las queratitis micóticas representan una de las formas más graves de infecciones corneales por su difícil diagnóstico y porque los antimicóticos no son tan efectivos como los antibióticos. Presentan escasa penetración corneal, se suelen utilizar en infecciones ya avanzadas y resulta más dificultoso obtener las preparaciones tópicas1,8.
En los últimos arios ha habido un incremento notable de reportes de infecciones por hongos2-3 posiblemente debido a la alteración de la flora bacteriana producto de la sobreutilización de antibióticos tópicos, la extensa utilización de corticoides y la mejora de los métodos de diagnóstico. Técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa y la microscopía confocal han sido de gran ayuda en la identificación y el posterior tratamiento de diferentes infecciones micóticas.
Los hongos acceden a la cór nea a través de un defecto epitelial que generalmente se debe a traumatismos con vegetales4, lentes de contacto2,5 o a enfermedades graves de la superficie ocular, y una vez en el estroma producen necrosis e inflamación. Pueden penetrar la membrana de Descemet intacta y de esta manera llegar a la cámara anterior.
La incidencia de las infecciones por hongos varía según la región y es más común en regiones con climas cálidos y húmedos. La flora normal de la superficie ocular incluye muchas especies de hongos6-7.
Las infecciones corneales producidas por Fusarium solani representan un tipo grave de la infección debido a la virulencia del hongo y su resistencia a medicamentos antifúngicos8. Puede causar complicaciones graves como descemetocele, perforación, endoftalmitis y pérdida visual irreversible9.
El efecto de los rayos ultravioleta (UV) en los microorganismos fue demostrado en numerosos artículos10-11 y los rayos UV se utilizan comúnmente en las salas de operaciones para mejorar las condiciones de esterilidad. En 1960 se descubrió que la riboflavina expuesta a los rayos UV puede inactivar el ARN de algunos virus12 y estudios recientes han demostrado que la riboflavina actúa como un fotomediador al inactivar patógenos en plasma, plaquetas y glóbulos rojos13-14. Además, se ha demostrado que el tratamiento combinado UV-A y riboflavina aumenta la resistencia de la córnea contra la digestión enzimática de los microorganismos15.

Materiales y métodos

Aislamiento de Fusarium solani
La cepa de Fusarium solani fue aislada de un paciente con queratitis micótica. El aislamiento fue cultivado en placas de agar papa dextrosa a 28°C. La preparación del inóculo se realizó por lavado la superficie del cultivo con Tween 80 al 0,1% en solución fisiológica estéril; luego se filtró la suspensión a través de dos capas de gasa estéril para retirar fragmentos de hifas. La suspensión de esporas fue transferida a un tubo estéril y centrifugado a 10.000 g. El sobrenadante se removió cuidadosamente con una pipeta estéril y las conidias (pellet) fueron resuspendidas en solución fisiológica estéril para producir el incóculo final de 8.6 x 104 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml.

Animales
El estudio incluyó a 24 conejos blancos New Zealand de peso 2,5-3 kg. Todos los conejos se trataron de acuerdo con las normas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el uso de animales en investigación oftalmológica y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Institucional. Los conejos fueron anestesiados con clorhidrato de ketamina intramuscular 50 mg/kg y xilacina 5 mg/ kg antes de todas las intervenciones. Para anestesiar las córneas se aplicó topicamente clorhidrato de proparacaína 0,5%. Se indujo queratitis por Fusarium en los ojos derechos mediante la inyección de 0,1 ml de una suspensión de E solani (8,6 x 103 UFC/0,1 ml) intraestromal en el centro de la córnea (fig. 1). Se dividieron aleatoriamente los conejos en dos grupos: el grupo tratado con crosslinking (UV-A/riboflavina) (CXL) y el grupo control.


Tratamiento
El tratamiento se realizó tres días luego de la infección (día 3). Los conejos fueron anestesiados intramuscularmente con una solución de hidroclorato de ketamina 50 mg/kg y xilazina 5mg/kg. Las córneas derechas de los conejos del grupo CXL fueron anestesiadas tópicamente con hidroclorato de proparacaína 0,5%. Un área de 7mm del epitelio corneal central fue desepitelizada manualmente. Como fotosensibilizador se aplicó una solución de riboflavina 0,1% (5-fosfato- riboflavina en 10 ml de dextran T-500 20%) cada 5 minutos durante 30 minutos previo a la irradiación y cada 5 minutos durante la irradiación. Después de permitir que la riboflavina penetrase la córnea se comenzó con la irradiación UV-A. Se utilizó el UV-X (IROC, Zurich, Suiza), que es un iluminador-UVA controlado por temporizador. La irradiación deseada de 3 mW/cm2 se controló con un contador de UY (Laser Mate-Q; LASER 2000, Wessling, Alemania) ad hoc. Las córneas derechas de los conejos se irradiaron con rayos UY (370 nm) a 1 cm de distancia durante 30 minutos con una intensidad de 3 mW/cm2, lo que corresponde a una dosis de 5.4 J/cm2.

Examen clínico
Se examinaron los ojos en el día 0, inoculación de los hongos, en el día 3, antes de realizar el tratamiento con CXL y en el día 7 (cuatro días después del tratamiento con CXL) con una lámpara de hendidura portátil para poder realizarle biomocroscopía. La extensión de la queratitis fue evaluada por un observador independiente a doble ciego. Se evaluó opacidad corneal, diámetro de la infiltración de la córnea y nivel de hipopión con el sistema de puntuación de Ozturk et al.16. Escala de edema corneal: O = córnea transparente, 1 = edema menor, 2 = edema corneal que ocupa dos cuadrantes de la córnea, y 3 = edema corneal total. El nivel de hipopión y el diámetro del infiltrado corneal se midieron en milímetros. El puntaje clínico para cada ojo se obtuvo de sumar los valores obtenidos del edema corneal, diámetro del infiltrado y nivel de hipopión.

Análisis microbiológicos y patológicos
El día 7 se extrajeron los botones esclerocorneales después de la eutanasia y nueve botones de cada grupo se enviaron a microbiología. La ruptura de las córneas se llevó a cabo en un mortero estéril y los botones se pesaron, se cultivaron en placas de agar con medio Sabouraud y se incubaron a 28°C durante 7 días. La cantidad de colonias se determinó en todos los cultivos. Otros tres botones de cada grupo fueron enviados para estudio histopatológico que se realizó con hematoxilina-eosina, ácido periódico de Schiff y giemsa.

Análisis estadístico
La cantidad de colonias de E solani obtenidas para cada botón se expresan en UFC/gr. Los resultados clínicos a los 0, 3 y 7 días fueron la suma de opacidad de la córnea, el diámetro de la córnea y el nivel de hipopión, de las puntuaciones obtenidas de cada conejo. Se realizó la prueba de Mann-Whitney para comparar las medias entre el grupo control y el grupo CXL en los diferentes días. El test de Wilcoxon (para dos muestras relacionadas) se utilizó para comparar la media de cada grupo entre los días O y 7. Ambas pruebas se realizaron con un nivel de significación de 0,05. Se utilizó el programa estadístico SPSS 17.0 (©2007 Sun Microsystems, Inc., Santa Clara, California, Estados Unidos).

Resultados
La queratitis por Fusarium solani se desarrolló en todos los ojos 72 horas después de la inoculación intraestromal. Los valores obtenidos del análisis de microbiología en el día 7 se presentan en la figura 2. Hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p = 0,01), lo que indica que la proliferación de Fusarium solani fue significativamente inferior en el grupo CXL. La evaluación patológica se detalla en la tabla 1. Las células inflamatorias en este proceso son: linfocitos, células plasmáticas y algunos neutrófilos, eosinófilos y mastocitos. En dos de los tres botones del grupo CXL se observaron menor cantidad de hifas de Fusarium, células inflamatorias y alteraciones inespecíficas del estroma en comparación con el grupo control (fig. 3). Los resultados clínicos obtenidos para cada grupo se presentan en la tabla 2. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos antes del tratamiento (día 0, p = 0,397 y el día 3, p = 0,702 (fig. 4a y c). Después del tratamiento con CXL, la diferencia en los resultados clínicos en el día 7 fue estadísticamente significativa entre los grupos (p< 0,001) (fig. 4b y d). Al analizar la progresión de la infección en cada grupo se vio que las diferencias de los resultados clínicos obtenidos en los grupos entre los días 3 y 7 fue estadísticamente significativa para el grupo control (p = 0,002), pero no lo fue para el grupo CXL (p = 0,223). Estos resultados indican que los conejos del grupo control desarrollaron infección, como se esperaba, mientras que los del grupo CXL desarrollaron la infección pero de menor intensidad.


Discusión
La queratitis micótica es reconocida como una causa importante de morbilidad ocular. En la actualidad, el tratamiento de enfermedades por hongos en los ojos no es satisfactoria.
Los agentes antifúngicos disponibles en el mercado son en su mayoría fungistáticos porque requieren de un tratamiento prolongado. Por lo tanto, los métodos actuales de tratamiento con frecuencia no logran preservar o restaurar la visión después de una queratitis micótica.
Alexandrakis informó que el 70% de las queratitis por Fusarium superficial responden al tratamiento médico, pero el 70% de las lesiones más profundas no responden a los agentes actualmente de uso tópico17. En la actualidad, los agentes más comúnmente empleados de uso tópico para la queratitis por Fusarium son la natamicina 5%, la anfotericina B 0,15% y los derivados azólicos.
Muchos estudios han demostrado que el crosslinking corneal no provoca efectos secundarios graves. En un estudio piloto, Wollensak et al. informó que la transparencia de la córnea y la del cristalino, la densidad de las células endoteliales y la presión intraocular se mantienen sin cambios después del tratamiento con CXL en pacientes con queratocono18. De hecho, no se encontró ningún efecto secundario grave en el grupo CXL en este estudio.
Se evaluó la eficacia del CXL tanto clínica como microbiológica. Tradicionalmente, la irradiación UV se utiliza para esterilización. Estudios in vitro demostraron un efecto antimicrobiano de amplio aspectro de la riboflavina/combinada con rayos UV19. El tratamiento de la queratitis micótica con crosslinking corneal (riboflavina y UV-A) parece ser efectivo en la disminución de la intensidad y la gravedad de las infecciones, pero este tratamiento no produce una remisión completa de la queratitis infecciosa por hongos.
En conclusión, la terapia de crosslinking corneal puede ser considerada útil como tratamiento coadyuvante al tratamiento médico en infecciones micoticas resistentes.

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