Resistencia a las Nuevas Fluoroquinolonas en Staphylococcus aureus Aislados de Queratitis Bacterianas en Relación con la Presencia de Mutaciones Específicas

Título

Autor

Silvia B. Rossetti

Leonardo P. D’Alessandro

Correspondencia

silvia_rossetti@fibertel.com.ar

Texto

Oftalmol Clin Exp 2007;1: 4-6

Resistencia a las Nuevas Fluoroquinolonas en Staphylococcus aureus Aislados de Queratitis Bacterianas en Relación con la Presencia de Mutaciones Específicas

Silvia B. Rossetti, Leonardo P. D’Alessandro

Resumen
Objetivo: Investigar la actividad in vitro de gatifloxacina (GAT) y moxifloxacina (MOX) en cepas de Staphylococcus aureus aisladas de queratitis bacterianas, con mutaciones en los genes de las enzimas DNA girasa (gyrA) y Topoisomerasa IV (grlA), resistentes a ciprofloxacina (CIP) y ofloxacina (OFX).
Material y Métodos: Se estudiaron 46 cepas de S. aureus resistentes a la CIP y OFX aisladas de queratitis bacterianas y 20 cepas susceptibles. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) para CIP, OFX, GAT y MOX por la técnica de dilución en caldo. Las mutaciones en los genes gyrA y grlA se realizaron utilizando una técnica de PCR-RFLP.
Resultados: Las cepas susceptibles no presentaron mutaciones y fueron sensibles a todas las fluoroquinolonas. Veintisiete de las 46 cepas resistentes tenían mutaciones en ambos genes gyrA y grlA, con CIMs de 32 a 256 μg/ml para CIP y OFX y CIMs de 4 a 64 μg/ml para GAT y MOX. Las restantes cepas sólo tenían una mutación en el gen grlA con CIMs de 16 a 32 μg/ml para CIP y OFX; de 0.12 a 4 μg/ml para GAT y de 0.06 a 4 μg/ml para MOX.
Conclusiones: MOX y GAT fueron activas in vitro en cepas de S. aureus resistentes a CIP y OFX portadoras de una mutación, aisladas de queratitis bacterianas. En cambio, MOX y GAT no fueron activas in vitro en cepas portadoras de dos mutaciones.
Palabras claves: Floroquinolonas, Sthaphylococcus aureous, resistencia bacteriana, mutaciones, queratitis bacteriana.

Resistance to the new generation of fluroquinolones and the presence of specific mutationws in Staphylococcus aureus isolated from bacterial keratitis

Abstract
Purpose: To investigate the in vitro activity of gatifloxacin (GAT) and moxifloxacin (MOX) in ciprofloxacin (CIP) and ofloxacin (OFX) resistant Staphylococcus aureus strains isolated from bacterial keratitis with mutations in the grlA and gyrA genes.
Material and Methods: Forty-six S. aureus strains, resistant to CIP and OFX isolated from bacterial keratitis and 20 susceptible strains were studied. The minimal inhibitory concentration (MIC) was established for CIP, OFX, GAT and MOX using the broth microdilution technique. GyrA and grlA gene mutations were identified using PCR-RFLP technique.
Results: Susceptible strains were sensible to all the fluoroquinolones and did not present mutations. Twenty seven of the 46 resistant strains had mutations in both genes, grlA and gyrA, their MIC were 32 to 256 μg/ml for CIP and OFX, and 4 to 64 μg/ml for GAT and MOX. The remaining strains only had one mutation in the grlA gene, with a MIC of 16 to 32 μg/ml for CIP and OFX, 0.12 to 4 μg/ml for GAT, and 0.06 to 4 μg/ml for MOX.
Conclusions: MOX and GAT were active in vitro in S. aureus strains carriers of one mutation isolated from bacterial keratitis resistant to CIP and OFX. On the other hand, MOX and GAT were not active in vitro, in S. aureous strains carriers of two mutations.
Oftalmol Clin Exp 2007;1: 4-6
Key words: Floroquinolones, Staphylococcus aureous, bacterial resistance, mutations, bacterial keratis.

Recibido 12/05/2007
Aceptado 27/06/2007
Laboratorio de Microbiología y Biología Molecular,
Fundación Oftalmológica Argentina Jorge Malbran (SBR) y Clínica Oftalmológica Malbran (LPD).
Correspondencia: Dra. Silvia Rossetti
Fundación Oftalmologica Argentina Jorge Malbran,
Buenos Aires, Argentina
Azcuénaga 1077 - PB. B-1115
silvia_rossetti@fibertel.com.ar

El Staphylococcus aureus es uno de los principales microorganismos productores de queratitis bacterianas. La resistencia de este germen a las fluoroquinolonas se ha incrementado en los últimos años tanto en cepas aisladas de infecciones sistémicas como oculares, y en especial dentro de los S aureus meticilino-resistentes.¹ Las fluoroquinolonasde 2^da generación como la ciprofloxacina (CIP) y la ofloxacina (OFX) son efectivas contra bacterias gramnegativas pero su actividad sobre grampositivas es limitada por la aparición de resistencia.² Las fluoroquinolonas de 4ta generación, moxifloxacina (MOX) y gatifloxacina (GAT), tienen mayor actividad sobre gérmenes grampositivos y mantienen su actividad sobre gamnegativos. Las fluoroquinolonas de 2da generación inhiben la síntesis del
DNA de bacterias grampositivas por acción sobre la Topoisomerasa IV, la MOX y la GAT, en cambio, tienen una acción dual sobre la DNA girasa (Topoisomerasa II) y la Topoisomerasa IV.³ Los mecanismos más comunes de resistencia a las fluoroquinolonas desarrollados por los S. aureus involucran mutaciones en los genes que codifican las subunidades A de la DNA girasa y la topoisomerasa IV (gyrA y grlA respectivamente), que se encuentran agrupadas en una región altamente homóloga llamada región determinante de resistencia a las quinolonas (QRDR). También se han descripto mutaciones en gyrB, gen que codifica la subunidad B de la DNA girasa y un mecanismo que consiste en la sobre-expresión del norA, gen que codifica a la proteína NorA. Esta proteína interviene en el transporte de las fluoroquinolonas y de otros compuestos no relacionados fuera de la bacteria.³
El objetivo de este trabajo fué estudiar cepas de Staphylococcus aureus aisladas de queratitis bacterianas, seleccionadas por ser resistentes in vitro a las viejas fluoroquinolonas y ser portadoras de mutaciones de resistencia, y comparar la susceptibilidad in vitro de distintas cepas de S. aureus a las 8-metoxi fluoroquinolonas, GAT y MOX, introducidas recientemente al mercado oftalmológico.

Materiales y Métodos
Se estudió la actividad in vitro de GAT y MOX en 46 cepas de S. aureus meticilino-resistentes y resistentes a las viejas fluoroquinolonas OFX y CIP, aislados de queratitis bacterianas. También se estudiaron 20 cepas de S aureus susceptibles a las fluoroquinolonas y a la meticilina aislados de queratitis bacterianas. Las concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs) para CIP, OFX, GAT y MOX fueron determinadas por la técnica de dilución en caldo de acuerdo a las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).⁴ En las cepas de S. aureus se detectaron la presencia de mecA y las mutaciones de resistencia a las fluoroquinolonas en QRDR para grlA en el codón 80 y para gyrA en el codón 84, mediante 3 técnicas de PCR independientes.^5-7 Para GAT y MOX se hallaron la CIM₅₀, CIM₉₀ y se calculó el cociente inhibitorio (C_max/CIM₉₀) utilizando los valores de la concentración corneal máxima (C_max) publicados por los laboratorios con las dosificaciones propuestas por los respectivos autores.^{8, 9} La Cmax utilizada fue de 48.5 μg/ml para MOX y de 15.7 μg/ml para GAT.

Glosario de términos utilizados
CIM₅₀: Concentración mínima de antibiótico necesaria para inhibir al 50% de las cepas.
CIM₉₀: Concentración mínima de antibiótico necesaria para inhibir al 90% de las cepas.
C_max: Concentración máxima de antibiótico que se obtiene en córnea utilizando terapia tópica.
IQ: Cociente Inhibitorio. Índice utilizado para predecir la eficacia antibacteriana de antibióticos concentración-dependientes. Se calcula con la fórmula C^max/CIM⁹⁰.
MPC: Concentración preventiva de mutaciones. Es la concentración de un antibiótico que previene el desarrollo de cepas resistentes por mutaciones.
mecA: el gen que codifica PBP2a, responsable de la resistencia a la meticilina y otros antibióticos β-lactámicos.
Concentración bactericida óptima y curvas de muerte bacteriana: Las fluoroquinolonas presentan una cinética de muerte bacteriana concentración-dependiente, por el contrario los antibióticos β-lactámicos son tiempo-dependientes con pocas diferencias de muerte bacteriana por encima de la CIM. Para las nuevas fluoroquinolonas la máxima muerte bacteriana se alcanza a 8 veces la CIM y el tiempo mínimo necesario para alcanzarlo es de 4 a 6 horas para los Staphylococcus.

Resultados
Las cepas susceptibles no presentaron mutaciones y fueron sensibles a todas las fluoroquinolonas (Tabla 1). Veintisiete de las 46 cepas resistentes tenían mutaciones en ambos genes grlA y gyrA; con CIMs de 32.0-256.0 μg/ml para CIP y OFX y CIMs de 4.0-64.0 μg/ml para GAT y MOX (Tabla 2). Las 19 cepas restantes sólo tenían una mutación en el gen grlA con CIMs de 16.0-32.0 μg/ml para CIP y OFX; de 0.12-4.0 μg/ml para GAT y de 0.06-4.0 μg/ml para MOX (Tabla 3). Las 46 cepas resistentes a las fluoroquinolonas fueron resistentes a la meticilina y presentaron el gen mecA.

Conclusiones
Las cepas estudiadas de Staphylococcus aureus susceptibles in vitro a las fluoroquinolonas no presentaron las mutaciones de resistencia gyrA y grlA.
La moxifloxacina y gatifloxacina fueron altamente activas (CIM 0.06-0,12 μg/ml y 0.06-0.5 μg/ml respectivamente) en las cepas de S. aureus susceptibles a las viejas fluoroquinolonas y no portadoras de mutaciones con CIMs inferiores a la CIP y OFX (CIM 0.12-2.0 μg/ml).
MOX y GAT fueron activas en cepas de S. aureus resistentes in vitro a CIP y OFX portadoras de una mutación en el gen grlA con CIM de 16.0 a 32.0 μg/ml para CIP y OFX comparadas con CIM de 0.12 a 4 μg/ml para GAT y 0.06 a 4.0 μg/ml para MOX. Estas concentraciones son fácilmente alcanzables con tratamiento tópico en el estroma corneal aún teniendo en cuenta que es deseable alcanzar tanto la concentración preventiva de mutaciones (4 veces la CIM) como la concentración óptima bactericida, es decir, el máximo efecto de la curva de muerte bacteriana (8 veces la CIM).
Las 27 cepas de S. aureus resistentes a las fluoroquinolonas y meticilina resistentes portadoras de dos mutaciones en gyrA y grlA presentaron CIMs para MOX y GAT de 4.0 a 64.0 μg/ml y por lo tanto fueron resistentes in vitro. Están en el límite de la concentración corneal que estos antibióticos pueden alcanzar sin tener en cuenta tanto la concentración preventiva de mutaciones como el máximo efecto de la curva de muerte bacteriana (4 a 8 veces la CIM).
Este estudio nos muestra que 27 de las 46 (58%) cepas de S. aureus resistentes a las viejas fluoroquinolonas y meticilino- resistentes aisladas de queratitis bacterianas, ya presentan mutaciones genéticas que pueden conducir al desarrollo de resistencias clínicas a las nuevas fluoroquinolonas. Es necesario implementar estrategias para evitar el desarrollo de resistencias bacterianas a las nuevas fluoroquinolonas.
El cociente inhibitorio (IQ) de 8 o más, nos permite predecir una excelente eficacia clínica de la MOX y GAT sobre cepas de S. aureus tanto sensibles a las viejas fluoroquinolonas como las resistentes portadoras de una mutación.¹⁰En cambio este cociente inhibitorio fue insuficiente en cepas resistentes portadoras de 2 mutaciones.

Referencias

Goldstein MH, Kowalsky RP, Gordon YJ. Emerging fluoroquinolone resistance in bacterial keratitis: a 5-year review. Ophthalmology 1999;106:1313-8.
Alexandrakis G, Alfonso EC, Miller D. Shifting trends in bacterial keratitis in south Florida and emerging resistance to fluoroquinolones. Ophthalmology 2000;107:1947-502.
Hooper DC. Mechanisms of actions and resistance of older and newer fluoroquinolones. Clin Infect Dis 2000;31:S24-S28.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A5. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.
Sreedharan S, Oram M, Jensen B, et al. DNA gyrase gyrA mutations in ciprofloxacin-resistant strains of Staphylococcus aureus: close similarity with quinolone resistance mutations in Escherichia coli. J Bacteriol 1990;172:7260–2.
Ferrero L, Cameron B, Manse B, et al. Cloning and primary structure of Staphylococcus aureus DNA topoisomerase IV: a primary target of fluoroquinolones. Mol Microbiol 1994;13:641–53.
Geha DJ, Uhl JR, Gustaferro CA, and Persing DH. Multiplex PCR for identification of methicillin-resistant staphylococci in the clinical laboratory. J Clin Microbiol 1994;32:1768-72.
Robertson SM, Sanders M, Jasheway D, et al. Penetration and distribution of moxifloxacin and ofloxacin into ocular tissues and plasma following topical ocular administration to pigmented rabbits. Presentado en Association for Research in Vision and Ophthalmology Meeting, 2003 (Abstract 1454).
Wittpenn JR, Pascucci SE, Donnenfeld E, et al. Determination of corneal absorption and penetration of topical gatifloxacin. Presentado en American Academy of Ophtalmology Meeting, 2004 (Abstract PA087).
Wilhelmus Kr. Evaluation and prediction of fluoroquinolone pharmacodynamics in bacterial keratitis. J Ocul Pharmacol Ther 2003;19:493-9.