Evaluacion de la Celularidad Estromal Corneal Mediante Microscopia Confocal en Lasek con Mitomicina

Título

Evaluacion de la Celularidad Estromal Corneal Mediante Microscopia Confocal en Lasek con Mitomicina

Autor

Carlos Argento
María José Cosentino
Juan Oscar Croxatto

Correspondencia

majocosentino@fibertel.com.ar

Texto

Oftalmol Clin Exp 2007;1: 14-20

Evaluacion de la Celularidad Estromal Corneal Mediante Microscopia Confocal en Lasek con Mitomicina

Carlos Argento, María José Cosentino, Juan Oscar Croxatto

Resumen
Objetivo: Evaluar el efecto de la Mitomicina C sobre la córnea como tratamiento coadyuvante del LASEK, mediante microscopia confocal.
Métodos: Se analizaron 25 casos operados con LASEK y Mitomicina C 0,02%. El equivalente esférico (EE) preoperatorio fue de -6,24 ± 2,24, con seguimiento de 2,06 ± 1,60 años. Todos los casos fueron realizados con el mismo excimer laser (Bausch & Lomb 217z, USA.). Se examinaron las córneas con microscopía confocal in vivo (Rostock Cornea Module, Heidelberg HRTII, Alemania). En cada imagen se cuantificó el número de pixeles del área reflectiva que representaba al conjunto de células, depósitos y aumento de la reflectividad de la matriz extracelular en relación al “background” (programa Sion Image for Windows, Sion Corporation, USA). Una población normal de 10 ojos fue utilizada como control. Se analizaron las diferencias entre los grupos con el t test, para muestras no apareadas de variancias desiguales (significativo p<0,05).
Resultados: El EE postoperatorio fue de -0,10 ± 0,52. No se observó haze. Análisis cualitativo. Se observo variabilidad en la celularidad (densidad y morfología), que varió entre imágenes hipocelulares a otras con células con morfología estrellada de pequeño y gran tamaño. En la matriz extracelular de algunos casos se observaron depósitos puntiformes y en forma de bastones, y aumento de la reflectividad. Análisis cuantitativo. En el grupo control, el área reflectiva media fue 32066 ± 4877 sp, rango 28033 a 37487 sp. En el grupo de LASEK, el área reflectiva media fue 51622 ± 10933 sp, rango 29050 a 70922 sp. Se encontró diferencia entre ambos grupos (p=0,01).
Conclusiones: Aun sin observarse clínicamente ningún grado de opacidad (haze) en pacientes tratados con LASEK y MMC, existen cambios celulares y de la matriz extracelular cuya intensidad no alcanza niveles suficientes para provocar haze. Oftalmol Clin Exp 2007;1: 14-20
Palabras claves: LASEK, mitomicina, haze, microscopía confocal corneal in vivo

In Vivo Confocal Microscopy of the Corneal Stromal Cells after LASEK with Mitomycin-C

Abstract
Objective: To evaluate the effect of mitomycin-C on the cornea as adjunctive therapy to LASEK, by means of confocal microscopy.
Methods: 25 cases operated on with LASEK with mitomycin-C 0.02 %. The preoperative spherical equivalent (SE) was -6.24 ± 2.24 and the follow-up was 2.06 ± 1.60 years. All cases were treated with the same excimer laser (Bausch & Lomb 217z, USA.).
In vivo confocal microscopy (Rostock Cornea Module, Heidelberg HRTII, Germany) was used. The number of pixels of the reflective area was quantitated in each image (Sion Image software for Windows, Sion Corporation, USA). A normal population of 10 eyes was used as control group. Differences between groups were analyzed by t-test for unpaired samples of unequal variances (significance: p < 0.05).
Results: Postoperative SE was -0.10 ± 0.52. No clinical haze was observed. Qualitative analysis: There were changes in cellularity with variability of images from hypocellularity to others with cells of stellate-shaped morphology of small and large size. In the extracellular matrix of some cases point- and cane-shaped deposits, as well as increased reflectivity, developed. Quantitative analysis: in the control group, the mean reflective area was 32066 ± 4877 sp while in the group undergoing LASEK, the mean reflective area was 51622 ± 10933 sp (Statistical significant difference p = 0.01).
Conclusions: Even though no haze was clinically observed in patients treated with LASEK and MMC, changes occur in both cells and extracellular matrix, the degree of which fails to reach sufficient levels to produce haze. Oftalmol Clin Exp 2007;1: 14-20
Key words: LASEK, haze, mitomycin, corneal confocal microscopy

Recibido: 23/06/08
Aceptado: 20/07/08
Instituto de la Visión, Buenos Aires, Argentina y Hospital de Clínicas “José de San Martín”,
Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina
Ninguno de los autores presenta intereses comerciales
Autor responsable: María José Cosentino,
MD, Instituto de la Vision. M.T. de Alvear 2261, Buenos Aires Argentina (C1122AAI)
E-mail: majocosentino@fibertel.com.ar

El uso del excimer laser ha sido popularizado en la última década. La queratectomía fotorrefractiva (PRK) ha probado ser segura y efectiva, aunque no desprovista de dolor y en ciertos casos de regresión miópica y algunas complicaciones como el haze.1-10
En l999 Massimo Camellin dio a conocer una nueva técnica: el LASEK (M. Cimberle, “LASEK May Offer the Advantages of Both LASIK and PRK”, Ocular Surgery News, March 1999, pag. 28). Este procedimiento consiste en crear una flap epitelial, ablacionar el estroma para corregir la ametropia y luego reposicionar dicho flap epitelial.
Durante los últimos dos años han aparecido una cantidad considerable de publicaciones sobre el procedimiento de LASEK.11-15 Algunos de estos reportes, no así otros tantos, analizan la incidencia de haze posterior a este procedimiento de superficie. Si bien se han estudiado ampliamente las características de la técnica y los resultados visuales, creemos fundamental analizar el haze y su potencial prevención con un antimetabolito como la Mitomicina C (MMC).16
En los últimos años se ha incorporado exitosamente el uso in vivo de la microscopia confocal con el objeto de observar las modificaciones inducidas por el LASIK.17- 28 Este estudio ha permitido visualizar los cambios estructurales de la cornea y la secuencia temporal de los mismos. Este examen provee además información importante para determinar la evolución postquirúrgica o evaluar los efectos de tratamientos combinados. El objetivo de este trabajo fue evaluar las modificaciones tisulares de la cornea a mediano y largo plazo con microscopía confocal in vivo después de laser assisted epithelial keratomileusis (LASEK) usando Mitomicina C.

Materiales y Métodos
Se estudiaron 25 ojos de 16 pacientes operados mediante la técnica de LASEK con Mitomicina C 0,02%. El promedio de edad de los pacientes fue de 35,25 ± 7.60 años. El promedio de miopia fue de 6,24 ± 2,24 (equivalente esférico), siendo la agudeza visual mejor corregida de 0,88 ±1,40. Todos los pacientes fueron operados con el mismo excimer laser (Bausch & Lomb z217, Bausch & Lomb, Miami, USA). El promedio de ablación fue de 92,45 ± 10,4 micrones.

Procedimiento de LASEK
Se indicó preoperatoriamente L-Cistina 1 gramo por día para mejorar la cicatrización epitelial desde 5 días previos a la cirugía hasta 10 días posteriores a la misma. Asimismo se indicó dexametasona 0,1% con tobramicina 0,3% y ácido hialurónico desde 24 horas antes a la cirugía con una dosis de carga de 1gota cada 5 minutos durante 25 minutos y tres veces por día hasta el momento de la cirugía.
Para la anestesia se instiló clorhidrato de proparacaina 0,5% cada cinco minutos durante la media hora previa a la cirugía. Se utilizó un trépano epitelial diseñado para LASEK de 8,0 mm de diámetro con profundidad calibrada y hinge superior (E-Janah 2900, Como, Italia). Se instilaron tres o cuatro gotas de una solución de alcohol al 20% (una parte de alcohol, cuatro partes de agua destilada) a través de un cono de 8,5 mm de diámetro (E-Janah 2905, Como, Italia) colocado sobre la cornea, dejando actuar la solución durante 40 a 45 segundos. Luego se retiró la solución introduciendo a través del cono una esponja de Merocel (Medtronic Solan, Jacksonville, USA). Antes de despegar el epitelio se lo movilizó con otra esponja de Merocel. Luego, la cornea fue abundantemente irrigada con solución fisiológica. Con una microniazada (E-Janah 2915, Como, Italia) se despegaron suavemente los bordes del flap epitelial y con una espátula acodada (E-Janah 2930, Como, Italia) se fue desprendiendo y plegando el flap hacia la hora doce.
Se preparó una ampolla de MMC 5 mg diluída en solución fisiológica al 0,02% (equivalente a 0,2 mg/ml) de la siguiente manera: se agregó 10 ml de solución fisiológica obteniendo una concentración de 0,5 mg/ml; luego se cargó en una jeringa y se diluyó para obtener la concentración deseada. Posteriormente se embebió una esponja de Merocel, dejando actuar la droga durante 75 segundos. Se realizó luego la ablación convencional del estroma con excimer laser (Technolas Keracor z2l7, Bausch & Lomb,
Miami, USA). Se reposicionó suavemente el flan epitelial con una cánula acodada en 90 grados. Se colocó un lente de contacto blando terapéutico de poder plano, con curva base de 8,4 mm.
Finalmente se indico dexametasona 0,1% con tobramicina 0,3% y ácido hialurónico cuatro veces por día durante el período de re-epitelización, indicando el uso de un oclusor plastico fenestrado durante las noches de dicho periodo. Una vez que la reepitelizacion se hubo completado, se retiró el lente de contacto y se indico acetato de fluorometolona 0,1% cuatro veces por día durante el primer mes, tres veces por día durante el segundo mes y dos veces por día durante el tercer mes acompañado de un lubricante sin conservantes en la misma proporción de veces que el corticoide mencionado.
Los pacientes fueron examinados al primer, segundo, tercero y cuarto día postoperatorio, o hasta el momento en que se retiró el lente de contacto. El siguiente control se llevó a cabo en la primera semana postoperatoria. Luego se realizaron controles al primer mes, segundo mes, tercer mes, sexto mes y duodécimo mes (en todos los cuales se midió la PIO debido a la medicación corticoidea). Entre el segundo y tercer mes operatorio se evaluó y calificó la presencia de haze. Fue considerado como haze incipiente aquel vagamente detectable; haze grado I como el que se detecta muy ligeramente y no compromete prácticamente la transparencia corneal; haze grado II aquel que presenta una opacidad moderada y no impide ver las estructuras posteriores; haze grado III el que presenta una opacidad densa y marcada obstaculizando la visibilidad del iris y haze grado IV aquel que presenta una opacidad severa e impide la visibilidad el iris. Entre el tercer y sexto mes se realizó un control de la topografia corneal (Plácido y de elevación) y sensibilidad de contraste. Los pacientes con grado III y IV fueron excluídos del análisis postoperatorio de la elevación posterior por el artefacto de la opacidad. En todas las examenes, a partir de la primera semana, se evaluó, además de la biomicroscopia, la agudeza visual sin corrección, la refracción y la mejor agudeza visual corregida.

Análisis con microscopía confocal
El examen con microscopía confocal in vivo de los pacientes se realizó utilizando el Rostock Cornea Module/ HRT II (Heildelberg Engineering GmbH, Dossenheim, Germany). El tiempo medio entre la cirugía y el examen con microscopía confocal fue 1,86 ± 1,49 años. Inmediatamente antes del procedimento se preparó al paciente con una gota de anestesico tópico (clorhidrato de proparacaina 0,5%) y un gota de viscoelástico de alta densidad (preferentemente ácido poliacrílico 0,2%, Acrylar, Poen, Argentina) en cada ojo. Se obtuvieron imágenes bidimensionales en escala de grises de la cornea y el limbo utilizando un objetivo de inmersión (X63) y un lente de campo 400 FOV, representando un área de 400 x 400 μm. La resolución de las imágenes es aproximadamente 1 μm/pixel (transversal) and 2 μm/pixel (longitudinal). El promedio de imágenes capturadas fue de 200 por ojo. Se obtuvieron imágenes de todo el espesor de la cornea desde la superficie epitelial hasta el endotelio espaciadas entre sí entre 2 y 5 μm en las mismas condiciones. Teniendo en cuenta la reflectividad de la matriz extracelular y células, se seleccionaron las imágenes mas representativas obtenidas inmediatamente por debajo del epitelio y la membrana basal (debido al LASEK la capa de Bowman no estaba presente). Las imágenes fueron todas recortadas a una superficie de 10 x 10 mm (384 x 384 pixels), equivalentes a 147,456 square pixels (sp) (formato gráfico bmp). En cada una de las imágenes se cuantificó el número de pixeles del área reflectiva que representaba al conjunto de células, depósitos y aumento de la reflectividad de la matriz extracelular en relación al “background” (programa Sion Image for Windows, Sion Corporation, USA). Debido a que la medición depende del nivel de umbral utilizado, el valor de reflectividad se obtuvo del promedio de tres imágenes con umbrales que mejor se ajustaban a la reflectividad de acuerdo a la imagen. Con el objeto de tener un valor de referencia para evaluar el grado de reflectividad del estroma subepitelial en LASEK, se midió de la misma manera la reflectividad del estroma superficial en 10 ojos de cinco sujetos con miopía y usuarios de lentes de contacto con similares características basales (clínicas) prequirúrgicas a las de los pacientes tratados. Los valores de reflectividad se expresaron en pixels al cuadrado y porcentajes en pixels de la superficie total. En estos ojos se evaluaron las imágenes capturadas inmediatamente por debajo de la capa de Bowman. Las diferencias entre los grupos se analizó con el test de t, para muestras no apareadas de variancias desiguales y se lo considero significativo para p<0,05.

Resultados
La Tabla 1 presenta las características epidemiológicas de la población en estudio mediante microscopía confocal. El promedio de equivalente esférico postoperatorio del grupo operado con LASEK y Mitomicina C fue de -0,10 ± 0,52, siendo la agudeza visual sin corrección de 0,83 ± 0,22 y la agudeza visual mejor corregida de 0,88 ± 0,18. Considerando la evaluación biomicroscópica, no se presentó haze en ninguno de los casos.


Análisis cualitativo de la celularidad corneal mediante microscopia confocal
En todos los casos tratados, el epitelio estaba en contacto directo con el estroma sin identificación de la capa de Bowman (Fig. 1). En 4 ojos de 3 pacientes se observaron células inflamatorias aisladas en epitelio y estroma superficial. En un ojo se observó aumento de espesor de la membrana basal y en otro un tracto cicatrizal en la interfase epitelioestromal. El plexo nervioso sub-basal estaba alterado en todos los pacientes con disminución de nervios, irregularidad del espesor, recorrido tortuoso y terminaciones abruptas (Fig. 2). En el estroma anterior subepitelial se observo marcada disminución y desaparición de queratocitos (Fig. 2).
En 11 ojos de 6 pacientes pacientes fue notable la presencia no confluente de células de configuración estrellada y citoplasma amplio correspondientes a queratocitos (Fig. 3). En la mayoría de los casos, el estroma superficial presentaba un aumento de reflectividad de la matriz extracelular con multiples puntos hiperreflectivos y depósitos en forma de aguja (Fig. 4). El análisis temporal de los cambios en el estroma anterior superficial revelo cambios en la presencia de células y reflectividad del estroma (Figs. 3-5). En 4 ojos de 3 pacientes se observaron células inflamatorias aisladas demostrando la presencia de leucocitos y linfocitos. El estroma medio y profundo no mostró cambios respecto a las imágenes observadas en los pacientes no tratados. El endotelio tenía aspecto normal con leve polimegatismo en todos los ojos. En 6 ojos de 5 pacientes se observaron pequeños puntos refringentes sobre el endotelio (Fig. 6).

Figura 1. Imagen oblicua de la cornea superficial, con el epitelio arriba. Ausencia de membrane de Bowman y estroma adyacente con nervios regenerados, depósitos puntiformes y reflectividad aumentada de la matriz extracelular.

Figura 2. Pérdida de queratocitos en el estroma corneal superficial con nervios regenerados y células inflamatorias aisladas.

Figura 3. Imagen del estroma corneal superficial, 3 meses luego de LASEK
con queratocitos estrellados.

Figura 4. Imagen de la córnea superficial 16 meses luego de LASEK con aumento de la reflectividad de la matriz extracelular y depósitos puntiformes, núcleos de los queratocitos y nervios regenerados.

Figura 5. Imagen de la córnea superficial 36 meses luego de LASEK con estroma hipocelular, aumento de la reflectividad del tejido posterior y unos pocos nervios regenerados.


Figura 6. Tes meses luego de LASEK, el endotelio corneal muestra polimegatismo moderado y multiples y pequeños puntos hiperreflectivos.

Figura 7. Box plot representando el porcentaje de reflectividad estromal superficial en ojos de pacientes no tratados (control) y luego de LASEK.

Análisis cuantitativo de la celularidad corneal mediante microscopia confocal
En el grupo de ojos tratados con LASEK y Mitomicina C el área reflectiva media fue 51.622 ± 10.933 sp, rango 29.050 a 70.922 sp. En el grupo control (ojos no operados) el área reflectiva media fue 32.066 ± 4.877 sp, rango 28.033 a 37.487 sp (p=0,01). La diferencia de reflectividad expresados en porcentajes entre los controles y los tratados con LASEK se ve en la figura 6. Los valores de pixeles expresados en porcentajes se agruparon en cuartiles (0, 25, 50, 75, 100). En el grupo control, 8 ojos estuvieron dentro del primer cuartilo (0-25%) y los dos restantes en el segundo cuartilo (25-50%). En el grupo tratado con LASEK y Mitomicina C, 13 ojos estuvieron dentro del segundo cuartilo (25-50%) y 16 ojos en el tercer cuartilo (50-75%).

Discusión
Aunque todavía subsisten controversias en el uso de LASEK, la técnica de LASEK con Mitomicina ha demostrado ser efectiva y segura para casos desafiantes (como corneas de bajo espesor, asimetrías corneales, y elevada queratometría) con nula incidencia de haze clínico en nuestra experiencia. 16
La microscopía confocal de cornea es un método de observación a nivel celular en tiempo real no invasivo permite demostrar los eventos que ocurren a través del tiempo facilitando la reconstrucción temporal de las modificaciones estructurales en la cornea. La microscopía confocal de cornea in vivo ha permitido dilucidar los cambios titulares corneales asociados a la cicatrización luego de la cirugía refractiva. Si bien hay numerosos estudios publicados sobre análisis in vivo mediante microscopia confocal sobre la cicatrización luego de PRK y LASIK,29-33 hasta muy recientemente no había publicaciones específicas referidas a LASEK.
Nakano et al.,34 publicaron recientemente un estudio comparativo, incluyendo microscopía confocal, entre LASEK y LASEK con mitomicina hasta 90 días después del procedimiento. El objetivo de este trabajo fue evaluar los cambios estructurales asociados con la cicatrización en una serie de pacientes operados con LASEK y MItomicina hasta pasados los tres años postoperatorios.
Debido a la similitud conceptual básica en la ablación superficial del estroma entre PRK y LASEK es razonable comparar los resultados de las observaciones con microscopía confocal entre las dos técnicas. Inmediatamente después de la PRK la reepitelización se completa en 92 hs.31 Como en la PRK, el LASEK destruye el plexo nervioso sub-basal en el área de ablación. El plexo nervioso sub-basal destruído en el área ablacionada, se comienza a regenerar dentro del primer mes y la densidad se completa en períodos variables, hasta 2 años después de la cirugía.29,31 Los nervios disminuyen en densidad, tamaño y longitud en el primer mes. La tortuosidad desaparece a los 3 meses y la densidad continua aumentado a los 6 meses.35-36 Teóricamente la reposición epitelial inmediata en LASEK, produce una inhibición de la activación de los queratocitos mediada por citoquinas. En ambos procedimientos, PRK y LASEK, la densidad y forma de los queratocitos cambia en las capas superficiales del estroma. Estas transformaciones celulares, tiempo dependientes, incluyen la aparición de células activadas similares a miofibroblastos que luego se transforman en queratocitos migratorios. La presencia de células estrelladas en el estroma se ve dentro del primer mes, luego de la PRK. Entre el tercer y sexto mes, se observa el decrecimiento de los queratocitos activados y de la hiper reflectividad del estroma anterior. El estadio final de la cicatrización es una unión tisular entre el epitelio y el estroma altamente reflectiva. En nuestra serie de casos se observaron, aún luego de 3 años post-LASEK, modificaciones tisulares como regeneración de los nervios sub-basales, decrecimiento de la celularidad, células estromales activadas, depósitos y cambios en la matriz extracelular. 33 En estudios de PRK en corneas donantes ex vivo, sin y con mitomicina, se ha demostrado que la exposición a mitomicina C (0.2 mg/mL) no produce mayor pérdida de queratocitos y retarda la repoblación por queratocitos del estroma anterior.33 Es razonable asumir que estos hallazgos pueden estar relacionados con el uso de Mitomicina. La cicatrización resultante en estos pacientes no estuvo asociada con haze. Algunos estudios han demostrado que ablaciones más profundas provocan mayor activación con aumento en el riesgo de haze.31 El haze clínico puede representar, en verdad, una combinación de aumento de la reflectividad con depósitos en el tejido cicatrizal y densidad aumentada de los queratocitos.29,37-38 Tanto en la PRK como en LASEK usualmente no hay daño del estroma medio y profundo, ni del endotelio.38 Nakano et al.,34 hallaron una reducción del recuento endotelial en pacientes tratados con LASEK y Mitomicina. Futuros estudios enfocados en el endotelio podrán dilucidar la significancia de los depósitos puntiformes encontrados en el endotelio de 6 ojos de nuestra serie, no asociados con pérdida celular.

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